PI3K/Akt通路調節LPS誘導的小膠質細胞內HSPA12B表達*

王 萍

(紹興市人民醫院，紹興 312000)

小膠質細胞(Microglia,MG)是中樞神經系統(Central nervous system,CNS)中天然免疫和適應性免疫的主要效應細胞。小膠質細胞的激活在神經退行性疾病的病理發生過程中發揮了重要的作用，參與多種神經退行性疾病進程，如阿爾茨海默病(AD)、帕金森病和多發性硬化癥等[1,2]。HSPA12B 是最近發現的HSP70 家族的新成員，與該家族其他成員相比較，有著自己特異的結構和功能[3]。在CNS應激過程中，HSPA12B發揮保護作用，可抑制神經細胞凋亡，維持血腦屏障通透性，減少腦缺血缺氧梗死面積等[4,5]。課題組已報道了HSPA12B作為炎癥反應蛋白在CNS炎癥過程中表達上調，參與小膠質細胞的炎性活化過程[8]。據報道，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白kinase B(PI3K/Akt)途徑參與HSPA12B神經保護作用的調節[5]。PI3K/Akt信號通路通過激活下游的NF-κB和GSK-3β/cyclin D1促進小膠質細胞的活化和增殖[6,7]。本研究旨在評價PI3K/Akt途徑在小膠質細胞炎性活化過程對HSPA12B表達的影響，為探討HSPA12B在CNS炎癥病程中功能的可能調節機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1主要試劑及來源 HAPI大鼠小膠質細胞由南通大學沈勤教授惠贈。DMEM培養基、胰蛋白酶(Gibco);LPS、TritionX-100(Sigma)。主要抗體抗HSPA12B多克隆抗體(Sigma);Akt、 phosphor-Akt (p-Akt)(Cell Signal);GAPDH、FITC Goat anti rabbit、Hoechst(Santa cruz)。

1.2方法

1.2.1細胞分組培養 細胞加入RPMI1640培養基(含100 U/ml青霉素、10 μg/ml鏈霉素、10 mmol/L-谷氨酰胺及10%小牛血清)于37℃、 5%CO2培養箱培養。細胞達到80%融合時換成無血清的RPMI1640培養基培養24 h后進行實驗。

將處于對數生長期的小膠質細胞隨機分為3組：①空白對照組。②LPS單一刺激組：取LPS終濃度均為0.1 μg/ml，刺激后繼續培養時間分別為2、4、6、8、12、24 h。③LY294002預處理1 h，再用LPS終濃度均為0.1 μg/ml刺激2 h組。

1.2.2Western blot 收獲各組培養細胞，1 ml 0.01 mol/L 預冷的 PBS刮下細胞。4℃，1 000 r/min離心15 min，棄上清。2×SDS蛋白裂解液溶解細胞沉淀，震蕩混勻后冰浴20 min。沸水煮10 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，取上清。蛋白質行10%SDS-PAGE，轉移到PVDF膜上，PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.6，150 mmol/L NaCl，0.5%Tween 20)洗滌3次，兔抗Ab4112多克隆抗體室溫孵育1 h，4℃過夜，TBST洗滌3次，HRP-標記的山羊抗兔抗體室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，用ECL(pierce)進行檢測，柯達膠片曝光顯影。

1.2.3免疫熒光細胞化學 HAPI細胞種到蓋玻片上，貼壁后用1 μg/ml LPS刺激2 h，4%多聚甲醛，室溫固定1 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次，加封閉血清，室溫2 h。吸去封閉血清，加入一抗混合液：兔抗大鼠Ab4112多克隆抗體(1∶100)，室溫孵育1 h后4℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次，加入二抗混合液： FITC偶聯的山羊抗兔IgG(1∶200)，Hoechst(1∶200)，避光，4℃孵育 1 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min×3次。熒光封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1LPS誘導的小膠質細胞中HSPA12B的表達 用0.1 μg/ml LPS分別作用 0、2、4、6、8、12、24 h。經不同時間刺激，HSPA12B的表達量不同。刺激2 h 后HSPA12B 蛋白表達開始增加，8 h后逐漸降至正常水平(見圖1)。

2.2LPS誘導小膠質細胞中PI3K/Akt的磷酸化 用0.1 μg/ml LPS分別作用 0、 2、 4、6、8、12、24 h。經不同時間刺激，磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表達量增加。刺激2 h后 p-Akt開始增加，6 h達到峰值，8 h 后逐漸降至正常水平(見圖2)。

圖1 不同作用時間的LPS對小膠質細胞中HSPA12B蛋白表達的影響Fig.1 Effects of different stimulation terms of LPS on HSPA12B protein in microgliasNote: *.P<0.05,vs control.

圖2 不同作用時間的LPS對小膠質細胞中Akt磷酸化蛋白表達的影響Fig.2 Effects of different stimulation terms of LPS on protein levels of phosphorylated Akt in microgliasNote: *.P<0.05,vs control.

圖3PI3K/Akt通路參與了LPS誘導的HSPA12B表達

Fig.3EffectsofPI3K/AktsignalingpathwayonLPS-inducedHSPA12Bproteinlevelsinmicroglias

Note: A.The effect of PI3K/Akt inhibitor LY294002 on the expression of phosphorylated Akt；B.The effect of LY294002 on the expression of HSPA12B；C.Quantitative analysis of the expressions of phosphorylated Akt and HSPA12B.*.P<0.05,versus the corresponding control；D.Immunocytochemical staining indicated that LY294002 could effectively inhibit the expression of HSPA12B induced by LPS in the cells.bar:10 μm.

2.3PI3K/Akt通路參與調節LPS誘導的小膠質細胞中HSPA12B的表達 應用PI3K/Akt特異的藥理抑制劑LY294002預處理小膠質細胞1 h，再用LPS終濃度均為1 μg/ml刺激2 h組。檢測PI3K/Akt通路的激活在LPS誘導HSPA12B表達中的作用。LY294002(10、50 mmol/L)以濃度依賴方式不同程度抑制LPS誘導的HSPA12B的表達(見圖3A～C)。

免疫熒光染色顯示，應用特異的藥理抑制劑LY294002(10 mmol/L)，可顯著抑制LPS誘導的HSPA12B的表達增加。上述結果提示在LPS誘導HSPA12B表達的過程中，PI3K/Akt通路發揮了極其重要的作用(見圖3D)。

3 討論

LPS作為小膠質細胞刺激因子，已經被大量用來研究AD與PD等病理發生發展過程中的炎癥進程，為之后的抗炎治療提供理論依據。在本研究中，我們報道了PI3K/Akt途徑參與調控LPS誘導小膠質細胞HSPA12B表達。 LPS 0.1 μg/ml作用后，HSPA12B在2 h表達增加，表達活性最高；同時Akt的磷酸化水平增強，應用PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預處理小膠質細胞，顯著抑制了LPS誘導HSPA12B蛋白水平的表達。

小膠質細胞是常駐CNS的單核吞噬細胞家族成員之一，具有免疫和炎癥雙重功能。在LPS誘導的細胞因子應答過程中，小膠質細胞發生活化，通過炎癥放大和神經元損失參與CNS神經退行性變[9]。HSPA12B 是最近發現的HSP70 家族的新成員。HSP70在CNS應激過程中高表達，這一現象被認為與炎癥過程中HSP70的神經元保護作用密切相關[10]。文獻報道了過表達HSPA12B，能顯著縮小MCAO引起的腦梗塞面積，顯著減輕海馬神經元損傷。在LPS誘導的炎癥過程中，HSPA12B的保護性作用也得到驗證，HSPA12B參與內皮細胞的炎癥反應，過表達HSPA12B可以減弱血管內皮細胞的炎性反應，從而保護心臟功能和抑制炎癥因子的合成[11]。本課題組曾首次報道HSPA12B 作為炎癥反應蛋白參與CNS的炎癥進程，參與小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，調節LPS活化的星形膠質細胞中炎癥因子(TNF-α、IL-1β)的表達[12]。LPS活化小膠質細胞，PI3K/Akt發生磷酸化增強。PI3K/Akt信號通路通過激活下游的NF-κB和GSK-3β/cyclin D1促進小膠質細胞的活化和增殖。PI3K/Akt途徑參與介導HSPA12B的保護性作用過程：介導HSPA12B的心臟保護作用；調節HSPA12B誘導的內皮細胞遷移；參與HSPA12B在腦缺血損傷中的抑制神經細胞凋亡與腦缺血/腦保護再灌注損傷[13,14]。本研究通過抑制PI3K/Akt通路，檢測對LPS誘導的小膠質細胞活化過程中HSPA12B表達的影響。應用PI3K/Akt通路的抑制劑LY294002預處理小膠質細胞，LPS誘導的HSPA12B的蛋白表達受到顯著抑制，細胞免疫熒光也顯示，細胞核內表達明顯減弱。實驗結果表明，PI3K/Akt途徑參與調節LPS誘導活化的小膠質細胞中HSPA12B的表達。

綜上所述，HSPA12B作為炎癥反應蛋白參與小膠質細胞活化過程，PI3K/Akt信號通路參與調節小膠質細胞炎性活化中HSPA12B的表達。這為進一步探討HSPA12B在小膠質細胞炎癥過程中的作用及機制，為CNS神經炎癥的治療尋找新的炎癥干預靶點提供基礎。

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