miR-34a調控PAX6的表達增強視網膜母細胞瘤的侵襲和遷移

黃玉嬋 吳 峰

(湖北科技學院眼科，咸寧 437100)

視網膜母細胞瘤(Retinoblastoma,RB)是兒童眼科惡性腫瘤中發病率和致盲率最高的腫瘤，在兒童中發病率約為0.5‰。不僅影響患兒的視力甚至可能致殘致死[1]。RB也是兒童腫瘤中發現的第一種與抑癌基因表達相關的眼科腫瘤。雖然目前可以通過手術加放療提高一定的治愈率，但僅局限于早期病變[2]。所以，RB早期發現和診斷有重大臨床意義，甚至可以大幅度提高治愈率。所以研究RB侵襲轉移的機制，尋找早期診斷的相關分子靶點成為RB研究的重點。

越來越多的證據表明，通過微小RNA(miRNA)介導的基因表達調控在控制細胞增殖和腫瘤發生中起重要作用[3]。miRNA是一類小的非編碼RNA，其在進化過程中呈現高度保守狀態，最近已經被證明可作為基因表達的有效調節劑。腫瘤抑制miRNA下調致癌miRNA過表達在腫瘤發生中起關鍵作用[4]。Katsura等[5]證明膀胱癌組織中miR-34a的表達水平異常，可影響腫瘤細胞增殖侵襲等行為。最近的一些研究表明，miR-34a水平在前列腺癌中下調，對胃癌和胰腺癌也有一定的調控作用[6,7]。

PAX6基因是PAX基因家族成員之一，可以編碼轉錄基因，在機體發育和疾病進展過程中扮演重要角色[8]。PAX6同時也是一種干細胞因子，在乳腺癌、胃腸惡性腫瘤中表達水平升高[9,10]，這表明PAX6可能影響腫瘤的發展過程。而且大部分腫瘤的發生過程中都存在一定程度的癌基因變異情況，許多相關因子也參與其過程，因此研究這些相關基因的功能及機制是惡性腫瘤的一種重要治療方向。本研究旨在揭示miR-34a和PAX6在RB中的表達及對細胞系的侵襲、遷移能力的影響，并初步探討其作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標本采集及處理 收集2015年1月～2016年1月在我院手術切除并且經病理檢查確診為RB組織50例，同時取正常視網膜組織50例。RB患者術前未進行放療。腫瘤組織離體后，去除血跡，放入4%多聚甲醛固定。所有組織標本的收取均獲得患者本人的同意并簽署知情同意書，并通過醫院倫理委員會的同意。

1.1.2細胞系和主要試劑 人RB細胞系(Y79、Rb50、Rb44、SM-106)購于中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。細胞均呈貼壁生長狀態，所用培養基為含10%胎牛血清的高糖培養基。PAX6、p-JAK、p-STAT一抗均購自 Abcam(ab233654、ab65524、ab75622)。miR-34a mimic購自上海吉凱制藥技術有限公司，Transwell小室購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學 將病理組織切片在60℃烤箱中孵育2 h。取出后在梯度酒精中水化15 min，滴加0.3%的H2O2溶液孵育15 min，使用PBS充分沖洗5 min； 滴加0.3% Triton-100，孵育15 min，增加細胞膜的通透性，使用PBS充分沖洗5 min； 加入配置好的一抗，4℃存放孵育過夜；吸去抗體，使用PBS充分沖洗5 min； 加入配置好的二抗，37℃孵育15 min，使用PBS充分沖洗5 min； 按照順序加入免疫組化ABC增強液，均在37℃下孵育15 min，加入DAB顯色液，進行免疫組織化學顯色，在顯微鏡下進行觀察，最后使用梯度酒精脫水后，中性樹脂封片保存，陽性細胞百分比對應值免疫組化結果陽性標準：陽性細胞百分比對應的值:將陽性的細胞數<5% 算為0分,5%～25% 1分,25%～50%為2分,50%～75%為3分,>75%為4分。然后將染色強度伊陽性細胞百分比對應的值作為評分，0～1為陰性,2～4為弱陽性,5～8為中陽性,9～12為強陽性。

1.2.2PCR 熒光定量PCR檢測miR-34a的表達 使用miRNA提取試劑盒進行miR-34a抽提，實驗過程按照試劑盒使用說明進行，抽提之后，使用核酸濃度檢測儀檢測RNA濃度和純度，最后將其濃度稀釋至50 μg/ml，使用特異性反轉錄引物進行cDNA合成，反應條件按照cDNA合成試劑盒使用說明進行設置，均使用U6作為內參。反應條件：95℃預變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火32 s，循環50次后檢測其溶解曲線，檢測完成后，通過計算機系統自動分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計算miRNA的相對表達量。實驗重復3次。miR-34a引物序列：5′-CACTCTATATAGTGTATCTTTC-3′(正向)和5′-GGCTTTTAGTGTACGTCGTAATG-3′(反向)，U6內參引物序列：5′-CCTAGGGAGATTGAGGGGCA-3′(正向)和5′-GGCTATTAGCTTGGAAACGA-3′(反向)。

1.2.3慢病毒載體感染Rb50細胞 將RB Rb50細胞置于含有10%胎牛血清DMEM培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中培育，取生長對數期的Rb50細胞，通過慢病毒轉染獲得過表達miR-34a的細胞，分別將編碼miR-34a-mimic的慢病毒感染到Rb50細胞中，以獲得過表達miR-XXX的細胞。并根據制造商提供的說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)將其轉染入細胞48 h，獲得具有穩定表達的miR-34a克隆細胞株。

1.2.4雙熒光素酶報告基因實驗 將miR-34a DNA片段克隆到ph-TK載體(腎臟熒光素酶)中，同時使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內部對照。根據 siPORTneoFX使用方法操作，在轉染后48 h制備裂解物。 然后根據制造商提供的說明書，使用雙熒光素酶測定系統(Promega，San Luis Obispo，CA)進行熒光素酶分析。實驗重復3次。

1.2.5Transwell侵襲實驗檢測RB細胞遷移能力 通過Transwell對細胞侵襲能力測定。將癌細胞在含有0.1%FBS的培養基中培養。 24 h后，將細胞接種在有基質膠的小室中，將具有10%FBS的培養基置于下腔中。在37℃下孵育24 h后，小心地去除上膜表面的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈過后，于倒置顯微鏡下計數。實驗重復3次。

1.2.6劃痕實驗檢測RB細胞遷移能力 劃痕實驗：將Rb44細胞轉染綠色熒光，劃痕時易于觀察細胞遷移狀況，將細胞接種在6孔板中并培養80%～90%匯合度。用無菌的200 ml移液管尖端刮擦細胞單層，產生寬度約1 mm的“傷口” (無細胞區域)。 將用無菌洗滌液洗滌2次。除去松散的細胞碎片，并用新鮮培養基更換。 處理前在相差顯微鏡下拍攝傷口的限定區域。 24、48及72 h后，再次拍攝相同的區域，并通過圖像確定剩余的傷口面積。采用傷口實驗期間的初始和最終傷口面積確定傷口閉合率，計算傷口閉合計算傷口閉合率=[(初始距離)-(最終距離)/(初始距離)]×100%。 實驗重復3次。

2 結果

2.1RB中miR-34a和PAX6的差異性表達 免疫組化結果顯示：PAX6定位在細胞膜和細胞漿，在RB組織中表達水平較高。miR-34a在RB組織中表達明顯低于正常視網膜組織。50例RB組織中，41例(82%)PAX6表達陽性；50例正常視網膜組織中，11例(22%)PAX6表達陽性(圖1)。表明RB組織中PAX6的表達明顯高于正常視網膜組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2miR-34a和PAX6之間的表達相關性 PAX6在RB患者和正常人之間的表達差異明顯，具有統計學意義(P<0.05)。miR-34a和PAX6在RB患者和正常人之間的表達陽性率差異明顯，具有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3PAX6在不同RB細胞株中的表達 Western blot實驗結果顯示：相比Rb50、Y79、SM-106細胞株，PAX6蛋白在Rb44細胞株中表達最低(圖2)，所以后續實驗選取Rb44 RB細胞作為實驗細胞株。

圖1 視網膜母細胞瘤中miR-34a和PAX6的差異性表達Fig.1 Differential expression of miR-34a and PAX6 in retinoblastomaNote: A.Immunohistochemical staining(×20);B.PCR.*.P<0.05.

2.4雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-34a與PAX6的靶向關系 通過生物信息學進行預測(targetscan)，miR-34a與PAX6蛋白的3′UTR端有相似的結合位點(圖3A)。結果發現，和對照組比較，RB Rb44轉染miR-34a-mimic后，PAX6的mRNA水平明顯降低(圖3B)。雙熒光素酶實驗檢測發現PAX6是miR-34a的直接靶點。這提示miR-34a是調控PAX6的一個關鍵因子。

2.5Transwell實驗檢測過表達miR-34a后視網膜母細胞瘤細胞的侵襲能力變化 Transwell實驗結果顯示如圖4示：miR-34a-mimic組穿透過基質膠的細胞數量明顯少于NC組[(186.25±7.75)% vs (47.75±5.76)%,P<0.05]，差異有統計學意義。該結果表明，過表達miR-34a的表達后可以有效抑制視網膜母細胞瘤Rb44細胞的侵襲能力。

2.6劃痕實驗檢測過表達miR-34a后視網膜母細胞瘤細胞的遷移能力變化 劃痕實驗結果表明(圖5)：與NC組相比，在24、48、72 h時，miR-34a-mimic組遷移率明顯降低[24 h (18.68±1.21)% vs(36.61±4.21)%，P<0.05;48 h (35.99±5.61)%vs (62.69±8.61)%，P<0.05;72 h (58.61±6.94)% vs (89.51±10.32)%，P<0.05]，差異有統計學意義。劃痕實驗表明過表達miR-34a可以抑制Rb44細胞的遷移能力。

2.7過表達miR-34a后JAK1-STAT3信號蛋白因子的表達變化 Western blot實驗結果顯示：與NC組相比，miR-34a-mimic組中p-JAK1和p-STAT3蛋白表達水平明顯降低[(68.15±6.75)% vs (11.52±4.34)%,(75.15±5.32)% vs (14.39±6.51)%，P<0.05]，非磷酸化JAK1和STAT3的表達無明顯變化，PAX6的蛋白表達水平也相應降低[(71.54±6.75)% vs (19.65±4.34)%]；說明miR-34a的過表達可以有效下調信號通路p-JAK1和p-STAT3蛋白的表達。

表1視網膜母細胞瘤與正常視網膜組織中PAX6和miR-34a的表達相關性

Tab.1CorrelationbetweenmRNAofPAX6andmiR-34ainretinoblastomaandnormalretinatissues

TissuesamplesmiR-34aPAX6PRetinoblastoma11.65%87.48%<0.05Normalretina88.35%12.52%

圖2 PAX6在不同視網膜母細胞瘤細胞株中的表達Fig.2 Expression of PAX6 in different retinoblastoma cell linesNote: RB50 group compared with other cell lines,*.P<0.05.

圖3 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-34a 與PAX6 的靶向關系Fig.3 Dual luciferase reporter assays verify targeting relationship between miR-34a and PAX6Note: A.Mutation sites between miR-34a and PAX6；B.PAX6 was regulated through miR-34a.Error bars represent standard error.*.P<0.05.

圖4 Transwell實驗檢測miR-34a的表達對Rb44細胞侵襲行為的作用(結晶紫染色，×40)Fig.4 Transwell assay to detect effect of miR-34a expression on Rb44 cell invasion(Crystal violet staining,×40)Note: *.P<0.05.

圖5 劃痕實驗檢測miR-34a的表達對RB44細胞遷移行為的作用Fig.5 Scratch experiment effect of miR-34a expression on migration of RB44 cells was examinedNote: *.P<0.05.

圖6 過表達miR-34a后p-JAK1和p-STAT3通路蛋白表達水平降低Fig.6 Expression of p-JAK1 and p-STAT3 pathway protein was down-regulation after overexpression of miR-34aNote: *.P<0.05.

3 討論

miRNA參與不同的生物學過程，如轉錄調節、細胞分化和腫瘤發生。 miRNA也被稱為細胞增殖的重要調節因子，最近報道miR-34a是一種腫瘤抑制因子[11-13]。miR-34a可能通過調節PI3K/Akt(磷脂酰肌醇3-激酶/Akt)和MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號通路，誘導腫瘤細胞生長的協同抑制[14,15]。最近，在鼻咽癌和結腸直腸癌中已經發現miR-34a表達異常[16,17]。然而，miR-34a在調節RB進展中的作用不是很清楚。第一部分的實驗結果顯示 miR-34a在視RB細胞中呈現出較低的表達水平，提示miR-34a的低表達可能與RB細胞的維持和自我更新有一定的關系。

PAX6是配對體基因家族的成員之一，其可以作為轉錄因子參與多種細胞的發育過程[18]。 PAX6首先在1991年被發現，是由422個氨基酸的多肽產物組成，其具有N-末端配對結構域(PD)，中間的同源結構域(HD)和富含絲氨酸/蘇氨酸的C-末端結構域，所有結構基序具有轉錄因子的特征[19]。 PAX6的功能研究發現其與垂體腺，神經內分泌細胞和胰腺胰島細胞的發育相關[20]。作為早期分化標記，PAX6也用于鑒定目前干細胞研究中神經元和神經內分泌細胞的前體構成[21]。PAX6在不同腫瘤中通過作用于不同信號通路發揮不同的作用，在視網膜母細胞瘤中PAX6的具體作用和作用機制尚未有研究詳細闡述。

JAK1和STAT3是屬于JAK/STAT家族中的轉錄活化因子蛋白，當 STAT3發生磷酸化的時候形成二聚體，并轉移進細胞核與染色體上靶基因啟動子進行結合，誘導位于其下游的基因即靶基因轉錄激活[22]。同時磷酸化的STAT3可以調控細胞G1/S期及G2/M 期的調控因子使細胞生存周期延長，進而促進細胞的惡性轉變[23]。STAT3和 P-STAT3在多種惡性腫瘤如肝癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌中均有異常表達，且持續高水平的 STAT3表達可引發其下游腫瘤相關基因的激活及表達，促進細胞增殖、新生血管形成及新陳代謝以及抑制抗腫瘤免疫反應的發生[24,25]。

本實驗是研究在體外環境下miR-34a靶向PAX6在視網膜母細胞瘤的作用。體外實驗表明miR-34a可以靶向PAX6調控視網膜母細胞瘤的生物學行為，且miR-34a 可能通過PAX6的表達而起到對視網膜母細胞瘤的抑制作用。而后面繼續通過Western blot驗證過表達miR-34a后JAK/STAT信號通路蛋白水平的變化顯示，miR-34a過表達后可能通過降低PAX6的表達下調p-JAK1和p-STAT3的蛋白水平，進而影響視網膜母細胞瘤的侵襲和遷移。

本研究表明miR-34a在視網膜母細胞瘤組織中表達降低，而PAX6在視網膜母細胞瘤組織中表達明顯增高，同時發現miR-34a可以靶向調控PAX6的表達，通過JAK1/STAT3信號通路調控視網膜母細胞瘤細胞的侵襲和遷移。提示miR-34a和PAX6可能參與視網膜母細胞瘤的發展過程，有可能成為預測視網膜母細胞瘤的發生和進展的標志物。

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