IL-34對類風濕關節炎髓系樹突狀細胞表型的影響*

張 振 孫曉彤 鄔秀娣 黃 華 李 霞 王 冰

(寧波市第一醫院， 寧波 315010)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)的主要病理特征為滑膜炎癥、滑膜增生，最終破壞軟骨及骨組織，其發病機制十分復雜。目前認為自身抗體產生與細胞因子異常表達都與RA的發病密切相關。RA自身抗體的產生往往與外周輔助性T細胞的過度活化有關，該輔助性T細胞可促進B細胞活化從而產生自身抗體[1]。而髓樣樹突狀細胞(Myeloid dendritic cells,mDC)是體內抗原提呈能力最強的細胞，mDC可通過直接接觸及分泌細胞因子誘導外周輔助性T細胞的生成[2]。因此mDC在自身抗體產生環節中發揮了重要作用。

近年發現IL-34參與RA的發病，但具體機制不詳[3]。生理狀態下IL-34含量很低，主要是參與維系髓系細胞的生存，促進巨噬細胞的分化[4]，但對DC的形成目前鮮有報道。因此本實驗通過檢測IL-34誘導下，其對RA單核細胞、單核細胞衍生的不成熟DC及成熟DC的表型表達的影響，初步探討IL-34對RA DC分化的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料 PBMC取材于2017年5月至2017年7月在浙江省寧波市第一醫院風濕免疫科住院RA患者，共30例，診斷均符合1987年美國風濕病學會(ACR)修訂的RA分類標準[5]，并均排除妊娠、其他自身免疫性疾病和其他急、慢性疾病。本研究中標本的采集均經過寧波市第一醫院倫理委員會的批準(批準文號：2017-05)，并取得患者的知情同意。

1.1.2試劑 RPMI1640、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購自美國Gibco公司，淋巴細胞分離液Ficoll購自天津灝揚生物制品科技有限責任公司，rhIL-4、rhGM-CSF、rhTNF-α購自PeproTech 公司，rhIL-34購自Miltenyi公司，PE-anti-CD83、anti-CD14,APC-anti-CD86單抗、鼠APC IgG 同型對照、鼠PE IgG 同型對照均購自eBioscience公司。

1.1.3實驗儀器 CO2細胞培養箱(Thermo公司)，流式細胞儀(BD 公司)。

1.2方法

1.2.1RA PBMC的分離培養 將每2 ml EDTA抗凝血于300 g離心5 min，吸取血漿保存。每管中加入2 ml PBS混勻。向15 ml管中加入4 ml Ficoll溶液，沿管壁將PBS混合血緩慢加入。500 g離心20 min，吸取中間白膜層(1～2 ml)置于另15 ml管中，加入PBS至12 ml離心：250 g，10 min。置24孔板中，10% FBS RPMI培養。

1.2.2DC細胞的誘導 將取出的PBMC按照密度1×106/ml/孔接種到24孔板中，靜置4 h后吸棄懸浮細胞。檢測IL-34對不成熟DC誘導表型的影響：將貼壁細胞分成3組，每組細胞分別加入GM-CSF(100 ng/ml)+IL-4(50 ng/ml)、IL-4(50 ng/ml)、IL-4(50 ng/ml)+IL-34(50 ng/ml)刺激3 d后分別加入對應的新鮮細胞因子繼續刺激2 d，收集細胞進行表型鑒定。檢測IL-34對成熟DC誘導表型的影響：將貼壁細胞分成3組，每組細胞分別加入GM-CSF(100 ng/ml)+IL-4(50 ng/ml)，刺激3 d后換新鮮的細胞因子繼續刺激2 d，然后再分別加入TNF-α(1 000 U/ml)、IL-34(50 ng/ml)、TNF-α(1 000 U/ml)+IL-34(50 ng/ml)刺激2 d，收集細胞進行表型鑒定。

1.2.3流式細胞儀檢測表型 將PBMC中貼壁的單核細胞、誘導的各階段DC分別加入Anti-CD83-PE、Anti-CD86-APC和(或)Anti-CD14-PE，4℃避光孵育30 min，PBS(含0.5%BSA)洗滌，流式細胞儀檢測各組細胞表面CD83、CD86和(或)CD14平均熒光強度。

2 結果

2.1IL-34聯合IL-4在誘導單核細胞分化過程中可促進其表達CD83、CD86 見圖1。流式細胞儀檢測結果顯示：與未誘導組相比，IL-34+IL-4誘導的DC表面CD83和CD86分子明顯升高，而CD14表達下降(P<0.005)。不同誘導組間對比，IL-34+IL-4組較GM-CSF+IL-4組CD83表達無差異(P>0.05)，CD86及CD14表達均下降(P<0.05)；IL-34+IL-4組較單純IL-4組DC的CD83及CD86表達均增加(P<0.05)，CD14表達無差異(P>0.05)。

2.2IL-34 在誘導不成熟DC分化過程中不能促進其表達CD83、CD86 見圖2。流式細胞儀檢測結果顯示：IL-34+GM-CSF+IL-4誘導的DC表面CD83和CD86與GM-CSF+IL-4組相比，表達差異無統計學意義(P>0.05)，與GM-CSF+IL-4+TNF-α組相比，CD83、CD86表達均下降(P<0.05)。

2.3IL-34 不能進一步促進成熟DC表達CD83、CD86 見圖3。流式細胞儀檢測結果顯示：IL-34在加入誘導的成熟DC體系后，細胞表面CD83水平較加入前表達下降(P<0.05)， CD86及CD14表達無明顯差異(P>0.05)。

圖1 不同細胞因子誘導單核細胞向不成熟DC分化表面CD83、CD86及CD14表達情況Fig.1 Expression of CD83,CD86 and CD14 was detected by FACS on immature cells induced by different cytokinesNote:*.P<0.05;**.P<0.005;***.P<0.000 5.ns.No significant.

圖2 不同細胞因子誘導不同階段DC表面CD83、CD86表達情況Fig.2 Expression of CD83 and CD86 on DC surface was induced by different cytokinesNote:*.P<0.05;**.P<0.005;ns.No significant.

圖3 IL-34對成熟DC誘導前后細胞表面CD83、CD86及CD14表達情況Fig.3 Expression of CD83,CD86 and CD14 on mature DC induced with or without IL-34Note:*.P<0.05;ns.No significant.

3 討論

RA是一種以關節滑膜炎癥為主要表現的自身免疫病，發病機制復雜。研究表明，炎性細胞因子的釋放、淋巴細胞過度活化和自身抗體生成是RA發病機制中的重要環節。T淋巴細胞活化需要抗原提呈細胞輔助，當T淋巴細胞被激活后，可分泌大量細胞因子并促進B細胞產生抗體，導致關節滑膜增生及炎性細胞浸潤，進而破壞關節的正常結構乃至引起系統性病變。本研究體外檢測IL-34對RA單核細胞向樹突狀細胞誘導分化過程中對其表型的影響，從而尋找IL-34參與RA發病的依據。

IL-34是白介素家族成員之一，是髓系細胞生存、增殖和分化的重要調節因子，尤其對單核細胞、巨噬細胞和破骨細胞的生存發育作用顯著[6]。IL-34與M-CSF可共用相同的受體CSF-1R，但兩者與受體結合的特點、信號通路模式仍存在差別[7]。除此之外IL-34在體內的表達具有組織特異性，皮膚角質細胞和處于靜息狀態的神經元可分泌IL-34，對朗格漢斯細胞和小膠質細胞的維持和發育發揮關鍵作用。相關研究表明體內某些細胞在應激狀態下可以分泌IL-34，這一過程受NF-κB信號通路調節[8,9]。這表明IL-34參與某些疾病的病理過程，其中包括RA。IL-34在RA患者血清及關節滑液中增高并與疾病活動度指標呈正相關[10]，此外IL-34還可刺激成纖維樣滑膜細胞及單核細胞分泌炎性因子，進而影響T細胞亞群的數量[11,12]。

DC主要由骨髓中髓樣祖細胞和淋巴樣祖細胞衍生而來，根據來源表型及功能的差異，DC又分為髓樣DC、漿細胞樣DC及來源于間充質干細胞的濾泡DC。其中髓樣DC是體內抗原提呈能力最強的細胞，未成熟狀態主要具有遷移、抗原加工處理等功能，成熟后能有效激活初始T細胞。由單核細胞衍生的成熟髓系DC高表達CD83、CD86，低表達CD14[13]。本研究檢測了IL-34誘導不同階段DC對其表型的影響，如結果所示，IL-34聯合IL-4可誘導單核細胞分化為不成熟DC，細胞表面CD83、CD86水平均上升，CD14表達下降，優于單獨使用IL-4，但較傳統GM-CSF聯合IL-4的作用略低；而IL-34誘導成熟DC分化的作用很弱，在使用GM-CSF、IL-4誘導單核細胞分化為不成熟DC后，再加入IL-34，發現CD83、CD86表達并沒有明顯變化，且在傳統誘導劑TNF-α誘導成熟DC分化過程中加入IL-34，前后對比發現CD86和CD14表達水平無差異，而CD83表達水平反而下降。該研究表明IL-34在單核細胞誘導分化為不成熟DC過程中發揮作用，雖然作用略弱于GM-CSF且對誘導成熟DC分化并不顯著，但仍可推測IL-34促進不成熟DC分化進而影響其抗原加工處理能力。

綜上所述，本研究通過揭示IL-34對不成熟DC的維系及分化具有較重要的作用，為IL-34參與RA的發病機制提供了新的線索，但具體機制尚需進一步深入研究探討。

參考文獻：

[1] Rao DA,Gurish MF,Marshall JL,etal.Pathologically expanded peripheral T helper cell subset drives B cells in rheumatoid arthritis [J]. Nature,2017,542(7639):110-114.

[2] Ueno H,Schmitt N,Palucka AK,etal.Dendritic cells and humoral immunity in humans [J]. Immunol Cell Biol,2010,88(4):376-380.

[3] Baghdadi M,Endo H,Tanaka Y,etal.Interleukin 34,from pathogenesis to clinical applications [J].Cytokine,2017,99:139-147.

[4] Foucher ED,Blanchard S,Preisser L,etal.IL-34-and M-CSF-induced macrophages switch memory T cells into Th17 cells via membrane IL-1α [J]. Eur J Immunol,2015,45(4):1092-1102.

[5] Arentt FC,Edworthy SM,Bloch DA,etal.The ARA 1987 revised criteria for classification on rheumatoid arthritis [J].Arthritis Rheum,1988,31:315-324.

[6] Foucher E,Blanchard S,Preisser L,etal.IL-34 induces the differentiation of human monocytes into immunosuppressive macrophages;antagonistic effects of GM-CSF and IFNγ [J].PLoS One,2013,8(2):e56045.

[7] Wei S,Nandi S,Chitu V,etal.Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 intheir CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells [J]. J Leukoc Biol,2010,88(3):495-505.

[8] Yu Y,Yang D,Qiu L,etal.Tumor necrosis factor-α induces interleukin-34 expression through nuclear factor-κB activation in MC3T3-E1 osteoblastic cells [J].Mol Med Rep,2014,10:1371-1376.

[9] Eda H,Shimada H,Beidler D,etal.Proinflammatory cytokines,IL-1β and TNF-α,induce expression of interleukin-34 mRNA via JNK-and p44/42 MAPK-NF-κB pathway but not p38 pathway in osteoblasts [J].Rheumatol Int，2011，31(2011):1525-1530.

[10] Chemel M,Goff B,Brion R,etal.Interleukin 34 expression is associated with synovitis severity in rheumatoid arthritis patients [J].Ann Rheum Dis,2012,71:150-154.

[11] Wang B,Ma Z,Wang M,etal.IL-34 upregulated Th17 production through increased IL-6 expression by rheumatoid fibroblast-like synoviocytes [J].Mediators Inflamm,2017.doi:10.1155

[12] Wang B,Tang Y,Sun X.etal.Increased IL-6 expression on THP-1 by IL-34 stimulation up-regulated rheumatoid arthritis Th17 cells [J].Clin Rheumatol,2017.doi:10.1007.

[13] 朱 娜,王海桃,李 昌,等.未成熟樹突狀細胞快速分離與體外誘導培養及其鑒定研究[J].中國免疫學雜志,2017,33(7):1043-1047.

Zhu N,Wang HT,Li C,etal.Isolation,induced culture and identification of immature dendritic cells[J].Chin J Immunol,2017,33(7):1043-1047.