醋酸棉酚誘導(dǎo)三株宮頸癌細(xì)胞DNA雙鏈斷裂研究

何人可， 湯小玲，　冉晨曦，　鐘建斌，　馬 影，　聶 聰， 趙 晉，　郭 忠

（西北民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730030）

棉酚（gossypol）是一種天然黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，主要存在于錦葵科植物棉花的根、莖和種子中。目前棉酚制劑主要有3種：醋酸棉酚、精制棉酚及甲酸棉酚[1]。棉酚最初作為男性避孕藥廣泛運(yùn)用于臨床。而近年來(lái)研究表明，醋酸棉酚（gossypol acetic acid，GAA）具有很顯著的抗腫瘤活性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系如宮頸癌、結(jié)腸癌、淋巴癌等產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞增殖并引起DNA損傷。抗腫瘤藥物可以引起DNA損傷，其中，DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）是最嚴(yán)重的，常常導(dǎo)致染色體畸變和細(xì)胞死亡[2]。本課題組的前期研究成果也證實(shí)了醋酸棉酚能夠誘導(dǎo)人粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞DNA雙鏈斷裂[8]。

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，據(jù)2012年報(bào)道，全球女性有宮頸癌52.8萬(wàn)病例，26.6萬(wàn)例死亡。尤其是發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌發(fā)病率呈上升和年輕化趨勢(shì)，占全球?qū)m頸癌發(fā)病的80%，嚴(yán)重威脅著廣大育齡婦女的健康和生命。人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）和宮頸癌的病原體，是最常見(jiàn)的性傳播全球病毒感染[3-4]。

本研究中根據(jù)細(xì)胞種類和感染HPV（人乳頭瘤病毒）16和HPV18的情況，分為宮頸腺癌Hela（HPV16-/HPV18+）、宮頸鱗癌 Siha（HPV16+/HPV18-）和 C-33A（HPV16-/HPV18-）[5]。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的GAA作用于這3株宮頸癌細(xì)胞，初步探討其殺傷腫瘤細(xì)胞的DNA雙鏈損傷機(jī)制，為GAA臨床用于化學(xué)治療宮頸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

宮頸癌細(xì)胞系Hela、Siha、C-33A，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。GAA，陜西宏達(dá)植物化工有限公司產(chǎn)品；DMEM，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，蘭州民海生物工程有限公司產(chǎn)品；MTT，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO），天津市德恩化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；DAPI，美國(guó)Molecular probes公司產(chǎn)品；PI，美國(guó)lsbio公司產(chǎn)品；鼠抗γH2AX單克隆抗體，美國(guó)Upstate Technology公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Olympus AX70熒光顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫分析儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠制造。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制Hela、Siha、C-33A細(xì)胞在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃的孵育箱中貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清、抗生素（100 μg/L 青霉素和 100 μg/L 鏈霉素）的 DMEM。每3～4天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。觀察終濃度為 2.5、5、10、20、40、80、160 μmo1/L 的 GAA對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela、Siha、C-33A的作用。以未加藥物組（control）作為對(duì)照。

1.2.2MTT細(xì)胞活性測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.1方法，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108個(gè)/L，接種至6孔板中，每孔2 mL，置37℃孵箱孵育。培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，加入含 GAA（20 μmol/L）的新培養(yǎng)基，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)取出。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela、Siha、C-33A細(xì)胞，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至7×107個(gè)/L，按每孔100 μL接種到96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。間隔8～12 h后，吸棄培養(yǎng)液，用含2.5～160 μmol/L GAA的新培養(yǎng)液處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和DMSO溶劑對(duì)照，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔490 nm的吸光度值（A490）。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下式計(jì)算出

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-M1/M0）×100%（1）式（1）中，M0為對(duì)照組吸光值平均值；M1為實(shí)驗(yàn)組吸光值平均值。

以Excel Forcast函數(shù)計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

1.2.3中性單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)收集不同濃度GAA處理24 h以及用20 μmo1/LGAA處理不同時(shí)間的Hela、Siha、C-33A細(xì)胞進(jìn)行中性單細(xì)胞凝膠電泳。

細(xì)胞計(jì)數(shù)：制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×107個(gè)/L。

制片：將50 μL 1 g/dL的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠（Agarose typeⅦ）均勻鋪開(kāi)于毛玻片上，室溫下放置備用。將400 μL的細(xì)胞和1.2 mL 1 g/dL低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠40℃下預(yù)熱，混勻后迅速鋪到第一層凝膠上（約1.4 mL），冰上固化3 min。

裂解：將載玻片浸沒(méi)于新配制的預(yù)冷裂解液中（含0.4～0.5 mg/mL蛋白酶K，使用前加入），4℃裂解l h，小心移入37℃孵箱孵育18～20 h。

解旋：TBE漂洗載玻片3次，每次30 min。將載玻片靜置于電泳槽中30 min。注意液面高于載玻片2 mm，避光。

電泳：調(diào)整緩沖液液面高度，使電壓為16～18 V，電流約 7 mA，電泳 25 min。

染色：體積分?jǐn)?shù)1%H2O2固定玻片10 min，雙蒸水充分洗滌。PI（終質(zhì)量濃度為5 μg/mL）染色30 min，置于密閉濕盒中，4℃保存。（在24 h內(nèi)觀察，以防止熒光淬滅）

觀察：在熒光顯微鏡（10×40 倍）紫外光（UV）的激發(fā)下，DNA圖像呈橘紅色。每個(gè)載玻片拍攝至少50個(gè)細(xì)胞，每個(gè)藥物劑量3張片子。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。圖片用CASP軟件分析。計(jì)算尾長(zhǎng)（Tail length）、頭部DNA百分含量（Head DNA%），尾部DNA百分含量（Tail DNA）、尾矩（TM）和 Olive尾矩（OTM）等指標(biāo)。TM定義為：遷移的平均距離與彗尾部DNA的分?jǐn)?shù)的乘積。OTM計(jì)算方法：尾部光密度重心與頭光密度重心之間的距離×尾部DNA百分含量[6]。

1.2.4免疫熒光染色

1） 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：Hela、Siha、C-33A 細(xì)胞培養(yǎng)同1.2.1方法，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108個(gè)/L，各取35 mm×10 mm培養(yǎng)皿6個(gè)，取100 μL細(xì)胞懸液接種至已放有蓋玻片上的 （蓋玻片硫酸浸泡過(guò)夜，清潔后用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡后過(guò)火，預(yù)先放入培養(yǎng)皿中），置37℃孵箱孵育2 h。每個(gè)皿加入DMEM培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)24 h后，吸去上清液，加入含GAA（20 μmol/L）的新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)取出。另外，用不同濃度GAA處理Hela、Siha、C-33A細(xì)胞24 h后取出。

2）免疫熒光染色檢測(cè)γH2AX焦點(diǎn)：免疫熒光檢測(cè)參照Macphail等[7]的方法，并稍作改動(dòng)[8]。被處理的細(xì)胞到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后，預(yù)冷的TBS洗滌2次；

固定：4 g/dL多聚甲醛固定20 min；TBS洗滌，5 min×3次；

破膜：體積分?jǐn)?shù)0.2%Triton-X 100破膜，15 min；TBS 洗滌，5 min×3 次；

封閉：TTN 浸泡 10 min；PBS洗滌，5 min×3次；

孵一抗：TTN稀釋鼠γH2AX單克隆一抗，體積比為 1∶500， 孵育過(guò)夜，TBS 洗滌，1 min×2 次；TTN洗滌1 min；

孵二抗：TTN稀釋山羊抗鼠FITC-IgG，體積比為 1∶200，孵育 1 h，TBS 洗滌，5 min×3 次，避光；

染核：DAPI終質(zhì)量濃度為 0.05 μg/mL，5 min，TBS 洗滌，5 min×3 次，注意避光；

封片：水性封片液封片，Olympus IX51熒光顯微鏡下觀察；

γH2AX焦點(diǎn)定量按Daniel等的方法[9]，用Image Pro Plus軟件進(jìn)行，γH2AX焦點(diǎn)定量計(jì)數(shù)，γH2AX焦點(diǎn)＞5為陽(yáng)性細(xì)胞。每張片子至少統(tǒng)計(jì)800個(gè)細(xì)胞。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：數(shù)據(jù)進(jìn)行Fish student t檢驗(yàn)。t檢驗(yàn)，p＜0.05，差異具有顯著性。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用mean±SEM表示，采用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，單因素方差分析檢驗(yàn)多組平均數(shù)之間的差別，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1　GAA對(duì)C-33A、Siha、Hela細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)體外GAA藥敏試驗(yàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行加藥培養(yǎng)，然后觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并用MTT法檢測(cè)GAA對(duì)3種細(xì)胞的增殖抑制作用，并用抑制率（%）和IC50來(lái)表示。IC50是衡量細(xì)胞化療敏感性的指標(biāo)之一。它是指細(xì)胞存活率為50%時(shí)的藥物濃度，IC50越大，化療敏感性越低。2.5～160 μmol/L的濃度范圍內(nèi)GAA對(duì)Hela、Siha、C-33A細(xì)胞的生長(zhǎng)呈明顯的抑制作用，呈時(shí)間-濃度依賴性。GAA對(duì)Hela、Siha、C-33A細(xì)胞作用 24 h的 IC50分別為 60.64、48.37、43.27 μmol/L，48 h 的 IC50分 別 為 49.59、39.61、37.25 μmol/L，72 h 的 IC50分 別 為 43.29、37.40、32.68 μmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GAA能夠明顯抑制3種細(xì)胞的生長(zhǎng)，IC50大小為C-33A

表1　GAA對(duì)C-33A細(xì)胞增殖的抑制作用Table 1　Inhibitory effect of GAA on the growth of C-33A cells

表2　GAA對(duì)Siha細(xì)胞增殖的抑制作用Table 2　Inhibitory effect of GAA on the growth of Siha cells

表3　GAA對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用Table 3　Inhibitory effect of GAA on the growth of Hela cells

圖1　GAA對(duì)C-33A、Siha、Hela細(xì)胞增殖抑制作用的差異性比較Fig.1　Difference comparison of inhibitory proliferation effect of GAA on C-33A、Siha and Hela cells

基于3株細(xì)胞IC50的數(shù)值，確定最佳藥物干預(yù)濃度為20 μmol/L。選取20 μmol/L GAA處理后不同時(shí)間，觀察細(xì)胞形態(tài)變化的時(shí)間依賴性。隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，越來(lái)越多的細(xì)胞皺縮、變圓、脫落。至48 h，細(xì)胞體積變小，大面積脫落，見(jiàn)圖2。

圖2　20 μmol/L GAA作用Hela細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)形態(tài)學(xué)變化Fig.2　Effect of 20 μmol/L GAA on cellular morphology of Hela cells at different time

2.2　中性單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)DSB

隨著GAA濃度的增加 （作用24 h），Hela細(xì)胞頭部DNA百分含量 （Head DNA%）降低，而尾長(zhǎng)（Tail length）逐漸變長(zhǎng)。 2.5～40 μmol/L 的 GAA 作用細(xì)胞24 h，或 20 μmol/LGAA分別作用 0～48 h，Hela、Siha、C-33A彗星細(xì)胞的頭部DNA百分含量（Head DNA%）減少，尾長(zhǎng)（Tail length）、彗星長(zhǎng)度（LComet）、尾部 DNA 百分含量（Tail DNA%）、尾矩（TM）和 Olive尾矩（OTM）增加，說(shuō)明 GAA對(duì)細(xì)胞DNA雙鏈損傷程度呈濃度時(shí)間-依賴性 （圖3，表4—表9）。其中，GAA對(duì)C-33A產(chǎn)生的DSB損傷最為嚴(yán)重，Siha次之，Hela最弱，但均明顯（圖4）。

2.3　GAA 誘導(dǎo) Hela、Siha、C-33A 細(xì)胞 γH2AX焦點(diǎn)的形成

觀察免疫組織化學(xué)法結(jié)果，20 μmol/L的GAA作用3 h，細(xì)胞內(nèi)即出現(xiàn)大量的綠色熒光焦點(diǎn)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，焦點(diǎn)數(shù)越多，亮度也增強(qiáng)，48 h時(shí)達(dá)峰值（圖 5）。 0～40 μmol/L 的 GAA 誘導(dǎo) Hela、Siha、C-33A內(nèi)H2AX發(fā)生磷酸化，形成焦點(diǎn)，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。我們發(fā)現(xiàn)，在同一濃度、同一時(shí)間下，C-33A產(chǎn)生的焦點(diǎn)最多，而Hela是最少的（圖6—圖 8，P<0.05）。

3　討論

宮頸癌是唯一病因明確、可以早期進(jìn)行預(yù)防的癌癥，但宮頸癌迄今仍是嚴(yán)重威脅婦女健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)其發(fā)病率居惡性腫瘤的發(fā)病率第三位，僅次于大腸癌和乳腺癌，其死亡率位居惡性腫瘤死亡率的第四位，僅次于大腸癌、肺癌和乳腺癌[9]。我國(guó)宮頸癌導(dǎo)致的患者死亡率從25歲開(kāi)始呈持續(xù)上升趨勢(shì)，在85歲達(dá)到頂峰。性生活混亂、早孕、多育、人口流動(dòng)性增大，使婦女罹患宮頸癌的危險(xiǎn)性隨之增大[10]。

圖3　GAA處理Hela細(xì)胞24 h的中性彗星圖像Fig.3　Representative images from the neutral comet assay showing the effects of different concentrations of GAA on Hela cells at 24 h

表4　GAA誘導(dǎo)C-33A細(xì)胞DNA斷裂的濃度效應(yīng)（24 h）Table 4　GAA induces DSB in C-33A cells in a dose-dependent manner（24 h）

表5　GAA誘導(dǎo)Siha細(xì)胞DNA斷裂的濃度效應(yīng)（24 h）Table 5　GAA induced Siha cells DSB in a dose-dependent manner（24 h）

表6　GAA誘導(dǎo)Hela細(xì)胞DNA斷裂的濃度效應(yīng)（24 h）Table 6　GAA induced Hela cells DSB in a dose-dependent manner（24 h）

表7　GAA誘導(dǎo)C-33A細(xì)胞DNA斷裂的時(shí)間效應(yīng)（20 μmol/L）Table 7　GAA induced C-33A cells DSB in a time-dependent manner（20 μmol/L）

表8　GAA誘導(dǎo)Siha細(xì)胞DNA斷裂的時(shí)間效應(yīng)（20 μmol/L）Table 8　GAA induced Siha cells DSB in a time-dependent manner（20 μmol/L）

表9　GAA誘導(dǎo)Hela細(xì)胞DNA斷裂的時(shí)間效應(yīng)（20 μmol/L）Table 9　GAA induced Hela cells DSB in a time-dependent manner（20 μmol/L）

圖4　GAA誘導(dǎo)C-33A、Siha、Hela細(xì)胞DNA斷裂的濃度、時(shí)間效應(yīng)的差異性比較（以Tail length為例）Fig.4　DNA damage difference comparison of dose and time effect of GAA on C-33A、Siha and Hela cells （Taking Tail length as an example）

圖5　20 μmol/L GAA處理不同時(shí)間誘導(dǎo)Hela細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)形成Fig.5　Immunofluorescence staining of γH2AX foci in Hela cells treated with 20 μmol/L GAA for different time

圖6　GAA誘導(dǎo)Hela、Siha、C-33A 細(xì)胞生成　γH2AX的濃度效應(yīng)（24 h）Fig.6　GAA induces γH2AX foci in Hela、Siha、C-33A cells in a dose-dependent manner

圖 7　GAA（20 μmol/L）誘導(dǎo) Hela、Siha、C-33A 細(xì)胞生成γH2AX的時(shí)間效應(yīng)Fig.7　GAA （20 μmol/L）induces γH2AX foci in Hela、Siha、C-33A cells in a time-dependent manner

圖8　GAA誘導(dǎo)Hela、Siha、C-33A細(xì)胞γH2AX焦點(diǎn)的形成差異性比較Fig.8　Difference comparison of foci formation of GAA on C-33A、Siha and Hela cells

無(wú)論是外源性的物理因素 （電離輻射、紫外線）、化學(xué)因素（化療藥物），還是內(nèi)源性的代謝產(chǎn)物，都能引起DNA雙鏈斷裂損傷，且這些損傷均能引起組蛋白H2AX發(fā)生磷酸化。當(dāng)輕微損傷時(shí)，細(xì)胞的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)發(fā)生停滯，DNA會(huì)對(duì)損傷進(jìn)行有效的修復(fù)；當(dāng)損傷過(guò)度時(shí)，則會(huì)激發(fā)細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序，造成細(xì)胞凋亡。而其中，DNA斷裂是損傷最嚴(yán)重的一種[11]。

本研究中采用3株同源細(xì)胞株：Hela、Siha、C-33A為研究對(duì)象，用MTT（Methyl Thiazolyl Tetrazolium）比色法和單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）分別對(duì)3株宮頸癌細(xì)胞的化療敏感性與DNA損傷進(jìn)行評(píng)估，并將SCGE與以γH2AX為指標(biāo)的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果進(jìn)行比較，探討將γH2AX做為一個(gè)潛在的分子靶點(diǎn)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，提高化療治癌療效的可能性。

我們知道，棉酚作為一種多酚類化合物，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[11]。它可以通過(guò)多種方式和分子靶向?qū)δ[瘤細(xì)胞進(jìn)行抑制增殖和（或）誘導(dǎo)凋亡，包括通過(guò)直接損傷線粒體抑制細(xì)胞能量代謝，調(diào)低細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白R(shí)b和cyclinD1蛋白的表達(dá)，抑制蛋白激酶C活性，調(diào)節(jié)多元耐藥基因的表達(dá)等[12]。本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)表明，在2.5～160 μmol/L濃度范圍內(nèi)，GAA對(duì)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，在對(duì) C-33A，Siha，Hela 3 株細(xì)胞的作用中，對(duì) HPV（-）的C33A細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最為明顯。在HPV（+）的2種細(xì)胞中，對(duì)Siha的抑制作用較Hela細(xì)胞明顯，這可能與GAA對(duì)宮頸鱗癌的抑制作用強(qiáng)于宮頸腺癌有關(guān)。

檢測(cè)DNA損傷的方法有很多，比如熒光原位雜交、彗星試驗(yàn)、高效毛細(xì)管電泳、序列凝膠電泳等[7]。但為了更準(zhǔn)確地通過(guò)DNA損傷程度來(lái)反應(yīng)腫瘤內(nèi)在敏感性，選取2個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)志物聯(lián)合測(cè)定是明智的[13]。本研究借助中性彗星電泳和免疫細(xì)胞化學(xué)法同時(shí)檢測(cè)DSB。γH2AX焦點(diǎn)與DSB的數(shù)量關(guān)系呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，γH2AX抗體熒光染色是檢測(cè)DSB存在的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。H2AX磷酸化形成γH2AX其實(shí)是一種保護(hù)機(jī)制，其主要功能是維持DNA損傷修復(fù)應(yīng)答分子持續(xù)地聚集在損傷位點(diǎn)周圍，從而間接修復(fù)DNA損傷[15]。所以，γH2AX可作為一個(gè)非常敏感的指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)各種原因所致的DNA損傷程度。相比于傳統(tǒng)的DSBs的檢測(cè)方法，細(xì)胞免疫化學(xué)法不僅能夠判斷DNA雙鏈的斷裂，還可以直觀計(jì)數(shù)γH2AX的表達(dá)和斑點(diǎn)數(shù)，操作簡(jiǎn)便，而且靈敏度高，是可行、可靠、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)DSBs的方法[16]。SCGE結(jié)果表明，GAA造成Hela、Siha、C-33A各細(xì)胞DNA雙鏈斷裂具有時(shí)間和濃度效應(yīng)（P<0.05）。本實(shí)驗(yàn)采用 的 Tail length（μm）、Comet length （μm）、Head DNA （%）、Tail DNA （%）、Tail moment（TM）、Olive tail moment（OTM）等多項(xiàng)指標(biāo)，能夠?qū)NA的損傷情況有較為全面的觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)相符，3株細(xì)胞對(duì)化學(xué)藥物的敏感性越強(qiáng)，所需干預(yù)濃度越低，而產(chǎn)生的DNA損傷效果越強(qiáng)。SCGE方法發(fā)現(xiàn)3株細(xì)胞在藥物處理48 h（20 μmol/L）或濃度40 μmol/L（24 h）后 DNA 斷裂最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，我們引入γH2AX這個(gè)分子靶點(diǎn)進(jìn)行DSB分析。免疫組織化學(xué)法結(jié)果與SAGE一致，即GAA有效地誘導(dǎo)了3株細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，在同一濃度、同一時(shí)間下，C-33A產(chǎn)生的焦點(diǎn)最多，而Hela是最少的。另外我們知道，E6、E7是存在于高危型HPV16/18病毒DNA上的決定性基因片段，2個(gè)經(jīng)典腫瘤抑制蛋白E6和E7通過(guò)與宿主細(xì)胞蛋白相互作用參與處理基因組穩(wěn)定，細(xì)胞黏附，細(xì)胞增殖、凋亡，細(xì)胞周期，DNA修復(fù)，代謝，翻譯和轉(zhuǎn)錄信號(hào)[17]。當(dāng)GAA造成細(xì)胞DSBs時(shí)，可能破壞或刪除了E6和E7基因且阻遏了E1和E2區(qū)域，導(dǎo)致其表達(dá)喪失，導(dǎo)致E6和E7表達(dá)水平增加[18-19]，導(dǎo)致細(xì)胞周期、有絲分裂異常。另外，有研究將HPV16 E6抗核酶導(dǎo)入宮頸癌細(xì)胞可顯著降低細(xì)胞的端粒酶活性，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，說(shuō)明抑制HPV DNA的表達(dá)，可提高腫瘤的化療敏感性[20]。同理，GAA可以通過(guò)抑制端粒酶活性和損傷DNA，提高兩種HPV陽(yáng)性細(xì)胞Siha和Hela的化療敏感性，故二者在相同濃度或相同時(shí)間作用下，產(chǎn)生的γH2AX比HPV陰性的C-33A更少。而宮頸鱗癌對(duì)GAA的敏感性強(qiáng)于宮頸腺癌，故Siha γH2AX陽(yáng)性率高于Hela。

在藥物損傷DNA后，若不能及時(shí)修復(fù)，DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制無(wú)法進(jìn)行，細(xì)胞從而走向凋亡。DNA斷裂修復(fù)分為以ATM重組為主的同源性重組和以DNAPK（Ku70/Ku80 異二聚體、DNA-PKcs）為主的非同源重組（NHEJ）2 條途徑[21]。 其中，NHEJ修復(fù)是人類最主要的途徑，低濃度GAA具有抑制DNA雙鏈斷裂的修復(fù)和具有增強(qiáng)化療敏感性的作用。有報(bào)道GAA誘導(dǎo)的MEC-1細(xì)胞 DNA雙鏈斷裂機(jī)制，有可能與NHEJ修復(fù)途徑中的DNA-PKcs有關(guān)，其過(guò)程大概是Ku70與Ku80形成異二聚體，再附于受損的DNA末端，共同激活DNA-PKcs，最后完成修復(fù)[22]。

4　結(jié)　語(yǔ)

綜上所述，近年來(lái)，棉酚作為一種抗腫瘤藥物受到越來(lái)越多的關(guān)注，棉酚的抗腫瘤研究展現(xiàn)了其藥用價(jià)值和臨床應(yīng)用的可能性，它引起的Hela、Siha、C-33A細(xì)胞DNA的斷裂為它成為有效的抗癌藥物提供了重要的理論依據(jù)。然而，引起雙鏈斷裂的機(jī)制并不是完全清楚。目前，有研究表明PI3K家族，包括DNA-PK，ATM和ATR參與了H2AX磷酸化的形成[23]。另外有研究表明，使用PI3K抑制劑渥曼青霉素作用細(xì)胞，再用IR處理后，γH2AX焦點(diǎn)形成急劇減少，提示H2AX的磷酸化是PI3K家族成員催化的[24]。隨著對(duì)棉酚的DSB機(jī)制的不斷研究和完善，為臨床應(yīng)用治療腫瘤打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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