綠豆環氧化物水解酶基因的克隆、分析及表達

姚 瑤，　胡　蝶，　鄔敏辰， 葉慧華

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫 214122）

手性環氧化物和鄰二醇是一類合成手性化合物的重要砌塊，被廣泛應用于醫藥、農藥、精細化工材料等的合成，如β-3腎上腺素受體激動劑、南部松小蠹誘劑和α-甜沒藥醇等的合成[1]。環氧化物水解酶 （epoxide hydrolase，EH，EC 3.3.2.3） 能選擇性水解環氧化物生成相應的鄰二醇[2]，例如，其水解外消旋環氧苯乙烷（（R，S）-SO） 可產生（R）-或（S）-苯基乙二醇（PED），該產物是液晶材料中不可缺少的手性添加劑，也是合成許多光學活性藥物和農藥的重要手性中間體。已發現的一些來源于動物、植物和微生物的EHs具有良好的對映選擇性和區域選擇性[3-4]。目前，對EH的研究主要集中在動力學拆分消旋體環氧化物制備手性環氧化物和鄰二醇，但其生成1，2-二醇的對映體過量值（e.e.值）普遍較低，且最大理論產率為50%。如Aspergillus niger LCP 52 ANEH和Cupriavidus metallidurans-CH34 CMEH 動力學拆分外消旋（R，S）-SO 獲得（R）-PED的 e.e.值分別為56%和51%[5-6]。

對映體會聚 （enantioconvergence）是指將2種構型的外消旋底物同時轉化成一種構型的產物，發生對映體會聚的水解反應[7]，其產物的最大理論產率為100%。許建和課題組從綠豆（Vigna radiata）中成功克隆出 2種 EHs基因 Vreh1[8]和 Vreh2[9]，并實現其在大腸桿菌 （Escherichia coli）中的異源表達，獲得的重組酶均能對映歸一性水解對硝基苯基環氧乙烷生成 （R）-對硝基苯基乙二醇，當轉化率為100%時，產物對映體過量e.e.值分別為70%和84.8%。本研究中通過對植物來源的EH進行基因多序列比對，設計2條簡并引物，采用RT-PCR和作者所在研究室建立的側翼未知DNA序列擴增技術THSO-PCR，克隆了一種新型綠豆EH的基因（Vreh3），并將其在 E.coli BL21（DE3） 中表達，利用該酶水解（R，S）-SO 制備（R）-PED。

1　材料與方法

1.1　菌株、質粒和培養基

E.coli JM109、BL21 （DE3） 和表達質粒 pET-28a（+）購自Novagen公司；克隆質粒pUCm-T購自上海Sangon公司；LB培養基：0.5 g/dL酵母提取物、1 g/dL蛋白胨和1 g/dL NaCl（固體培養基添加2 g/dL瓊脂粉），pH 7.2。

1.2　主要試劑和儀器

綠豆，購自超市；UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒，購自上海Sangon公司；Ex Taq和rTaq DNA聚合酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶和RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒，均購自大連 TaKaRa公司；（R，S）-SO 和（S）-PED，購自上海薩恩化學技術有限公司。氣相色譜儀GC-2010，購自日本Shimadzu公司產品；手性氣相色譜柱CYCLOSIL-B（30 m×0.25 mm×0.25 μm），購自美國Agilent科技公司產品。

1.3　綠豆總RNA及基因組DNA提取

選取飽滿的綠豆種子置于培養皿中，加入少許去離子水覆蓋培養皿底層，于37℃培養箱中孵育12 h，取發芽綠豆胚芽，使用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取綠豆總RNA。采用簡化CTAB法[10]提取綠豆基因組DNA。

1.4　PCR引物的設計

將 Vignaradiata（ADP68585）、Glycinemax（NP_001238563） 和 Phaseolus vulgaris（XP_00714 7002）等21條來源于植物的EH氨基酸序列進行比對，在近N端和C端區域各選取一段保守序列（MHVAEKG） 和（AHFNNQ），分別對應其設計簡并引物VrEH-F1和VrEH-R1，用于Vreh3基因部分cDNA序列的擴增；根據上述引物擴增獲得的cDNA序列，在近其N端和C端非保守區分別設計特異下游引物VrEH-R2和特異上游引物VrEH-F2，用于Vreh3基因5′端DNA和3′端cDNA序列的擴增。根據獲得的 Vreh3基因 3′端 cDNA和 5′端 DNA序列，設計上下游引物VrEH-F和VrEH-R，用于克隆Vreh3基因編碼區DNA和cDNA序列。T-發卡結構序列HSO-T和引物HSO-F參照胡蝶[11]等所述方法合成。除試劑盒內引物，其余引物和HSO-T均由上海Sangon公司合成，見表1。

表1　PCR擴增引物和T-發卡結構序列Table 1　Primers and T-hairpin structure sequences for PCR amplification

1.5　Vreh3基因序列的擴增

1.5.1Vreh3基因3′端cDNA序列的擴增以綠豆總RNA為模板，Oligo dT-AP為引物，按照TaKaRa RNA PCR Kit（Ver.3.0）說明書進行反轉錄合成cDNA的第一鏈。以該鏈為模板，VrEH-F1和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR擴增。以第一輪PCR產物為模板，VrEH-F1和VrEH-R1為引物進行第二輪PCR擴增獲得Vreh3基因部分cDNA片段，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收目的條帶，連接pUCm-T載體，轉化E.coli JM109，經藍白斑篩選后，送上海Sangon測序。然后，以第一輪PCR產物為模板，VrEH-F2和M13 Primer M4為引物進行第二輪PCR擴增，獲得部分cDNA片段。合并2次第二輪PCR擴增的cDNA片段獲得Vreh3基因3′端cDNA序列。

1.5.2Vreh3基因5′端DNA序列的擴增參考胡蝶[11]等的 THSO-PCR技術擴增 Vreh3基因 5′端DNA。以HSO-T發夾結構與酶切修飾后綠豆基因組DNA的連接產物為模板，HSO-F與VrEH-R2為引物進行PCR擴增獲得Vreh3基因5′端DNA序列。1.5.3Vreh3編碼區DNA和cDNA序列的擴增以綠豆基因組DNA為模板，VrEH-R和VrEH-F為引物進行PCR擴增獲得Vreh3基因編碼區DNA序列。以逆轉錄合成cDNA第一鏈為模板，以VrEH-F和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR；以第一輪PCR產物為模板，VrEH-F和VrEH-R為引物進行第二輪PCR：94℃ 3 min，30個循環（94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s），72 ℃ 10 min，獲得 Vreh3基因編碼區cDNA序列，PCR產物回收后與pUCm-T連接，轉化E.coli JM109，測序正確的重組質粒命名為pUCm-T-Vreh3。

1.6　生物信息學分析

利 用 NCBI ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析 Vreh3開放閱讀框；BDGP（http：//www.fruitfly.org/index.html）預測轉錄起始 位 點 ；PLACE （http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）預測順式調控作用元件；ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/） 工具分析 VrEH3理化性質；DNAMAN 6.0和ClustalW2軟件用于蛋白質一級結構的分析。

1.7　Vreh3在 E.coli BL21（DE3）中的表達

以cDNA第一鏈為模板，以VrEH-F和M13 Primer M4為引物進行第一輪PCR；以該輪PCR產物為模板，VrEH-F和VrEH-R為引物進行第二輪PCR獲得Vreh3基因編碼區cDNA序列，產物回收后與pUCm-T連接，轉化E.coli JM109，測序正確的重組質粒命名為pUCm-T-Vreh3。

用Nde I和Xho I雙酶切pUCm-T-Vreh3，割膠回收目的基因Vreh3，與經同樣雙酶切的pET-28a（+） 連接，獲得重組表達質粒 pET-28a（+）-Vreh3，轉化E.coli BL21（DE3），獲得工程菌命名為E.coli BL21/pET-28a（+）-Vreh3。在 IPTG終濃度 0.15 mmol/L，16℃誘導表達重組VrEH3。100 mL誘導發酵液經8 000 r/min離心收集菌體，用5 mL磷酸鉀緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0） 懸浮，用于 SDS-PAGE分析及活性測定。不含目的基因的pET-28a（+）轉化E.coli BL21（DE3）作為空白對照，命名為E.coli/pET-28a（+）。

1.8　氣相色譜分析及計算

樣品分析采用氣相色譜儀GC-2010、手性氣相色譜柱CYCLOSIL-B和氫火焰離子化檢測器。進樣口和檢測器溫度均為250℃；初始柱溫100℃，以5℃/min升溫至210℃；載氣為氮氣，流速3.0 mL/min，分流比 1∶50。在此檢測條件下，正己醇、（R）-SO、（S）-SO、（S）-PED 和 （R）-PED 的保留時間分別為3.738、6.368、6.492、17.437 min 和 17.574 min。 （R）-PED 摩爾產率 =（S/RS0） × 100%，e.e.=[（S-R）/（S+R）]× 100%； 其中：S和 R 分別代表 （S）-和 （R）-PED的最終摩爾濃度，RS0代表（R，S）-SO的初始摩爾濃度。

1.9　EH活性的測定

在 2 mL EP管中加入 800 μL菌液和 150 μL磷酸鉀緩沖液 （100 mmol/L，pH 7.0），25 ℃預熱 5 min；加入 50 μL（R，S）-SO（200 mmol/L），25 ℃反應3.5 h后8 000 r/min離心2 min， 取100 μL上清液于1 mL乙酸乙酯 （含1 mmol/L的正己醇作為內標），激烈震蕩，8 000 r/min離心2 min，吸取上層有機相，經無水硫酸鎂干燥，過0.22 μm有機膜，按1.8方法進行氣相色譜分析。

2　結果與分析

2.1 Vreh3基因序列的擴增

2.1.1Vreh3基因3′端cDNA序列的擴增據1.5所述，以VrEH-F1和M13 Primer M4為引物進行PCR 獲得約 1 800 bp的條帶（圖 1（a） 泳道 1）；以VrEH-F1和VrEH-R1為引物，第二輪PCR產物獲得約 850 bp條帶（圖 1（a）泳道 2）；以 VrEH-F2和M13 Primer M4為引物，第二輪PCR產物獲得約400 bp、500 bp 2 條清晰的條帶（圖 1（a） 泳道 3），測序結果顯示約500 bp處條帶為Vreh3基因序列。合并2次第二輪PCR產物獲得的序列，獲得的Vreh3基因3′端cDNA序列長1 080 bp。

2.1.2Vreh3基因5′端DNA序列的擴增不同限制性內切酶酶切基因組構建了3個PCR模板庫，以HSO-F和VrEH-R2為引物分別進行PCR擴增，獲得約 2 100 bp、220 bp 和 220 bp 的條帶（圖 1（b））。測序結果顯示3個條帶均為Vreh3基因5′端DNA序列。

2.1.3Vreh3基因編碼區DNA和cDNA序列的擴增用DNAMAM軟件分析3′端cDNA序列確定終止子為TAA，設計特異性下游引物VrEH-R；用BestORF分析5′端DNA序列確定起始密碼子ATG的位置，設計特異性上游引物VrEH-F。以綠豆總RNA逆轉錄合成cDNA第一鏈為模板，VrEH-F和VrEH-R為引物，經二輪PCR擴增獲得Vreh3基因的編碼區cDNA長約960 bp（圖1（c）泳道1）。以綠豆基因組DNA為模板，VrEH-F和VrEH-R為引物，經PCR擴增獲得Vreh3基因的編碼區DNA長約1 200 bp的序列（圖1（c）泳道2）。測序獲得編碼區cDNA序列為 957 bp（GenBank登錄號為KR013755），編碼區DNA序列為1 178 bp。

2.2　Vreh3的核酸序列分析

用DNAMAN合并擴增獲得Vreh3序列，編碼區DNA序列包含2個142 bp和79 bp的內含子和957 bp的開放閱讀框，編碼318個氨基酸。利用BDGP預測，位于起始密碼子ATG上游的94 bp處的鳥嘌呤（G）為轉錄起始位點；利用PLACE分析在轉錄起始位點上游22 bp處發現真核生物中典型的TATA-box，在終止密碼子下游360 bp處發現AATAATA的多聚腺苷酸加尾信號，分析結果表明Vreh3的5′-非翻譯區和 3′非編碼區長分別為 94 bp 和 446 bp（圖 2）。

2.3　VrEH3氨基酸序列分析

利用ProtParam分析VrEH3的理論相對分子質量和等電點分別為36.2×103和5.59。通過將VrEH3與不同來源的5種EH進行氨基酸序列比對，發現VrEH3 與來源 于 Glycine max（NP_001238563）、Glycine max（NP_001240943）、Vigna radiata（ADP685 85，VrEH1）[8]、Phaseolus vulgaris （XP_007147002）和Solanum lycopersicum （XP_004230258）的EH氨基酸序列同源性分別為80.8%、73.9%、72.4%、71.6%和66.0%（圖3）。根據文獻報道分析，VrEH3保守的Asp101、Asp262和 His297組成催化三聯體，Tyr150和Tyr232為質子供體。

圖1　Vreh3序列擴增的PCR產物Fig.1　PCR products of the amplification of Vreh3

圖2　Vreh3的核酸序列分析Fig.2　Analysis of nucleotide sequence of Vreh3

2.4　Vreh3在E.coli中的表達

構建的重組菌VrEH3按1.7方法進行誘導表達。SDS-PAGE分析結果顯示，VrEH3全細胞在約30.1×103處有特異性目的條帶（圖 4，泳道 2），小于VrEH1（約 41.0×103）[8]和 VrEH2（約 36.0×103）[9]的相對分子量；E.coli/pET-28a（+）在該處無特異性條帶（圖 4泳道 1），表明 VrEH3成功在 E.coli BL21（DE3）中表達。

圖4　重組大腸桿菌表達產物的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of the expressed products by recombinant E.coli

2.5　VrEH3 對映歸一性水解（R，S）-SO

按1.9所述方法，誘導后的工程菌E.coli/Vreh3 對10 mmol/L（R，S）-SO 進行水解反應，反應進程如圖5。結果表明，VrEH3優先水解（S）-SO，而對（R）-SO 反應較慢。 在 0～2 h內，（S）-SO 的摩爾濃度迅速降低，（R）-SO的e.e.值迅速上升，同時產物e.e.值一直保持在95%以上。當反應3.5 h時，（S）-SO 全部水解，（R）-SO 的 e.e.值＞99%，得率為20.6%；產物（R）-PED 的 e.e.值為 94.7%，得率為79.4%，高于綠豆粉水解（R，S）-SO 生成（R）-PED的最大 e.e.值（82.7%） 和最高得率（48.2%）[12]。目前，大部分報道的重組表達EHs，如A.niger ANEH[5]，Sphingomonassp.HXN-200SpEH[13]和Agrobacterium radiobacter AD1[14]EchA等均具有較高的對映選擇性，通過酶動力學拆分的制備（R）-或（S）-SO，其 e.e.值＞99%，得率＜50%，但（R）-或（S）-PED的e.e.值并不高。少部分EHs，如Caulobacte crescentus CcEH[15]，Solanum tuberosum StEH[16]和 綠豆VrEH1[8]和VrEH2[9]等具有對映體歸一性，其中CcEH 和 StEH 歸一性水解（R，S）-SO 生成（R）-PED的e.e.值分別為90%和86%，均小于VrEH3獲得（R）-PED 的 e.e.值（94.7%）。 該結果說明 VrEH3 不僅具有較好的對映選擇性，且具有良好的對映體歸一性（如圖6），有著廣闊的應用前景。

圖 5　對映歸一性水解（R，S）-SO的時間進程Fig.5　Time course of enantioconvergent hydrolysis of（R，S）-SO

圖6　VrEH3催化水解（R，S）-SO的反應Fig.6　Catalytic hydrolysis reaction of （R，S）-SO by VrEH3

3　結　語

本研究運用不同PCR技術，從綠豆中獲得了一種新型環氧化物水解酶基因Vreh3，并成功實現了在E.coli中的異源表達。初步測定重組VrEH3活性，發現VrEH3對映歸一性水解（R，S）-SO可同時獲得高對映體純的（R）-SO（e.e.值＞99%） 和（R）-PED（e.e.值為94.7%）。VrEH3可作為一個良好的生物催化劑，對于制備高純度的手性環氧化物或鄰二醇具有巨大的潛在應用價值，其催化機理及應用需進一步研究。

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