麥苗酵素發酵工藝的優化及其抗氧化功能

馮彥君，　張　慜*，　韓宇斌

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.海通食品集團有限公司，浙江 慈溪 315300）

大麥苗是禾本科越年生草本植物大麥的幼苗，其營養豐富，所含維生素、礦物質及蛋白質是人類與動物的必需營養，還含有葉綠素、黃酮類物質、活性酶、維生素等生物活性物質[1]。大麥苗有著悠久的食用藥用歷史，我國明代醫藥學家李時珍就在《本草綱目》中寫到：“麥苗，氣味辛、寒、無毒。主治消酒毒、暴熱，酒疽、目黃，并搗爛絞碎濾服之，又解蠱毒；煮汁濾服，除煩悶。除時疾狂熱，退胸隔熱，利小腸。作苗，甚益顏色[2]”。近年來，大麥苗制作的保健食品以其獨特營養價值及保健作用，在日本、美國等發達國家也倍受關注。而在我國，現在大麥苗保健食品及其相關研究還很少。

“酵素”本是酶（enzyme）的舊譯，后來也被用來稱呼一些發酵產品，如植物酵素、環保酵素、酵素菌肥等；而植物酵素指以新鮮蔬菜、水果等植物為原料，經多種益生菌發酵而產生的，含有豐富的酶、維生素、礦物質和次生代謝產物的微生物制劑[3-4]。按照生產過程中是否人為接種菌種，酵素可以分為天然酵素和人工酵素2類。天然酵素生產工藝簡單，但生產周期較長；人工酵素生產工藝復雜，但生產周期短，且產品質量較穩定。本文中的麥苗酵素屬于人工酵素。研究表明植物酵素具有消炎、抗菌、抗氧化、凈化血液、促進細胞新生、增強免疫力等作用[4]，有些還表現出了一定的抗腫瘤作用[5-6]。因其較好的保健功能，植物酵素在日本以及我國臺灣地區大受歡迎。盡管國內市場上也出現了一些植物酵素產品，但數量仍然很少，還有廣闊的發展空間。

本文作者以大麥幼苗為原料，通過勻漿、滅菌、發酵等步驟，制成麥苗酵素產品。酵母菌通過本身的代謝過程，使底物產生一系列的生物化學變化，實現營養物質之間的相互轉化，為產生新的生理物質如各種酶、維生素及次級代謝產物等提供前體物。因此發酵后的產品，其營養價值遠遠超過了麥苗本身。對于麥苗酵素，超氧化物歧化酶（SOD）是其主要的功效酶之一。SOD是一類重要的抗氧化的酶，廣泛存在與人類和各種生物中，具有很強的抗氧化的作用，清除體內的超氧離子自由基，保護機體免受自由基的傷害，所以在抗癌、抗衰老、抗炎癥、抗輻射等疾病中具有不可忽視的作用[7]。盡管外源性酶的攝入與人體內源酶含量的關系比較復雜，但已有一些研究證明，雖然其機理尚不清楚，口服外源性SOD酶確實可使人體內SOD酶活性升高[8-9]，且有利于治療一些疾病[10]。

本文中以SOD酶活力為指標，對麥苗酵素的發酵工藝進行了優化，以期為麥苗酵素發酵的工業化生產提供理論依據；同時研究了其抗氧化能力，測定了包括過氧化氫酶（CAT）活力、總酚質量濃度以及羥基自由基清除率在內的抗氧化指標，為進一步探明麥苗酵素中的活性物質提供一定的數據資料，為大麥苗的多功能開發提供一個新的思路。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

大麥苗，海通食品集團產品；活性干酵母，安琪酵母股份公司產品；硫酸鎂、氯化鋅、甲硫氨酸、十二水合磷酸氫二鈉、一水合磷酸二氫鈉、體積分數30%過氧化氫、無水碳酸鈉、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、沒食子酸（均為分析純），核黃素、福林酚、氯化硝基四氮唑藍、酵母膏（均為生化試劑），國藥集團化學試劑有限公司產品；JYL-C020九陽榨汁機，九陽股份有限公司產品；GM1010光照度測試儀，深圳聚茂源科技有限公司產品。

1.2　實驗方法

1.2.1工藝流程麥苗→勻漿→調配，滅菌→接種

菌→恒溫發酵→麥苗酵素

1.2.2操作要點

1）大麥苗勻漿液的制備：將大麥苗挑選去雜，用無菌水洗凈，稱取15 g，加100 mL無菌水，用打漿機打成勻漿。

2）發酵基質的制備及滅菌：向大麥苗勻漿液中添加以下營養物質 （以大麥苗質量為1）：酵母膏0.2%、硫酸鎂0.1%、氯化鋅0.1%，磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀各0.05%[11]。調節pH，使初始pH保持在6.0左右。蔗糖（碳源）質量按每次實驗的需要（參見1.2.4，下同）添加。然后用紫外燈滅菌1 h，準備接種。

3）酵母菌接種及發酵：將活性干酵母活化后按每次實驗的需要量接種到冷卻后的發酵基質中，于恒溫培養箱中恒溫發酵一定時間，所需溫度及時間按每次實驗的需要設定。發酵后的上清液即為麥苗酵素產品，取樣進行測定。1.2.3主要指標檢測方法

1）SOD活力的測定：取干凈的具塞試管若干，編號，2支為對照管，其余為測定管，按要求加入酵素液，并做3次平行。混勻后將1支對照管置于暗處，其他各管于4000lx光照下反應20 min（各管受光條件一致）。反應結束后立刻避光，不照光的對照管做空白，在560 nm處測吸光值，以抑制NBT光還原的50%為一個酶活力單位，計算活力，公式如下式（1）：

式（1）中，SOD總活力以每克麥苗酵素質量的酶單位表示 （U/g）；ACK為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；Vt為測定時樣品用量（mL）[12]。

2）CAT活力的測定：取10 mL試管3支，其中2支為測定管，1支為空白對照管，按下表順序加入試劑。

S0號管在沸水浴中煮1 min以殺死酵素液中的酶液，冷卻。將所有試管在25℃下預熱后，逐管加入0.3 mL 0.1 mol/L的H2O2，每加完一管立即計時，并迅速導入石英比色皿中，在240 nm下測定吸光度，每間隔1 min讀數1次，共測4 min，待3支管全部測定完后，計算酶活力。做3次平行測定。

以每分鐘A240減少0.1的酶量為1個酶活力單位（U）：

式（2）、（3）中，AS0為加入煮死酶液的對照管的吸光度；AS1

、AS2

為樣品測定管的吸光度；VS為測定時所用酶液體積（mL）；t為從加H2O2開始到最后一次讀數的時間；0.1為A240下降0.1時的1個酶活力單位（U）[12]。

4）總酚質量濃度的測定：配制0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液，分別取該標準溶液0、0.1、0.2、……、0.5 mL于10 mL刻度試管中，加入5 mL H2O、1 mL福林酚試劑和2 mL質量分數10%Na2CO3，加水定容到刻度，在760 nm下測吸光度A760，繪制標準曲線。以0.5 mL酵素液代替標準溶液重復上述步驟，根據標準曲線計算總酚質量濃度[13-14]。

5）羥基自由基清除率的測定：向2 mL 1.5 mmol/L FeSO4、1.4 mL 6 mmol/L H2O2、0.6 mL 20 mmol/L 水楊酸鈉的混合溶液中加入135 μL酵素樣品，37℃恒溫水浴1 h，在562 nm處測定吸光度A562（去離子水作參比溶液），以抗壞血酸為陽性對照。羥基自由基清除率的計算公式如式（4）：

羥基自由基清除率（%）=100×[A0-（A1-A2）]/A0（4）式（4）中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品測定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度[15]。

1.2.4麥苗酵素酵母發酵工藝條件的優化待優化的工藝條件包括發酵溫度、酵母接種體積分數、發酵時間、蔗糖（碳源）添加質量分數等。

1）發酵溫度對麥苗酵素SOD及CAT活力的影響：發酵溫度影響酵母菌的生長情況，進而影響其SOD等代謝產物的生成，因此對酵素液中的活力具有很大的影響；此外溫度本身對于酶活的影響也很大，故在此處除SOD外，還測定了CAT的活力，來研究溫度對于酵素中酶活的影響。將酵母接種體積分數固定為0.67%，分別控制溫度為27、32、37℃進行發酵，發酵時間為12 h，發酵后測定酵素液SOD及CAT活力，確定最適發酵溫度。

2）酵母接種體積分數對麥苗酵素SOD活力的影響：酵母接種體積分數直接影響著酵母產SOD的量及活力，需要通過實驗確定最佳接種體積分數。將發酵溫度控制在32℃，蔗糖（碳源）添加質量分數為6.7%，分別接種體積分數為0.33%、0.50%、0.67%、0.83%、1.0%的酵母菌進行發酵，發酵時間分別為6、12 h和18h，發酵結束后測定其SOD的活力，確定最適酵母菌接種體積分數。

3）發酵時間對麥苗酵素SOD活力的影響：發酵時間影響著酵母的生長量及SOD的活力，將發酵溫度固定為32℃，接種酵母0.67%（體積分數），在蔗糖（碳源）添加質量分數分別為3.3%、5.3%和6.7%（以大麥苗質量為1）時，將發酵時間設置為6、9、12、15 h，發酵結束后取樣測其SOD的活力，確定最適發酵時間。

4）蔗糖（碳源）添加質量分數對麥苗酵素SOD活力的影響：本文以蔗糖為額外的碳源，其添加質量分數將影響酵母的生長狀況，進而影響其SOD活力。將發酵溫度固定為32℃，酵母接種體積分數固定為0.67%，將蔗糖添加質量分數（以大麥苗質量為1）分別設置為 3.3%、5.3%、6.7%、8.0%、10.0%，分別發酵9、12 h和15 h，考察不同蔗糖添加質量分數對麥苗酵素SOD活力的影響[16]。

2　結果與討論

2.1　酵母菌發酵工藝優化

2.1.1發酵溫度的確定發酵溫度為27℃時，麥苗酵素SOD及CAT活力最低，隨著溫度升高，SOD及CAT活力隨之增高，但當發酵溫度超過32℃時，麥苗酵素SOD及CAT活力反而隨之降低如圖1所示。分析得出32℃為酵母菌發酵生產麥苗酵素的適宜溫度。故實驗發酵溫度確定為32℃。

2.1.2酵母接種體積分數的確定在3個發酵時長的條件下，當酵母接種體積分數小于0.67%時，麥苗酵素活力都隨接種體積分數增加而增高；當酵母接種體積分數大于0.67%時，麥苗酵素SOD活力隨接種體積分數增加而降低；而麥苗酵素SOD活力均在酵母接種體積分數為0.67%時達到最高；3個發酵時長相比，12 h時SOD活力最高如圖2所示。分析認為當酵母接種體積分數超過0.67%時，種內斗爭加劇而導致酵母菌代謝減弱，從而導致SOD酶活力下降。

圖1　發酵溫度對麥苗酵素SOD及CAT活力的影響Fig.1　Effect of fermentation temperature on the activityof SOD and CAT in Barley ferment

圖2　酵母接種體積分數對麥苗酵素SOD活力的影響Fig.2　Effect of yeast inoculation quantity on the activity of SOD in Barley ferment

2.1.3發酵時間的確定在3種蔗糖（碳源）添加質量分數的條件下，隨著發酵時間的增加，麥苗酵素SOD活力均逐漸增加，在12 h之后略有下降，而在12 h時活力達到最大；蔗糖添加質量分數為5.3%時麥苗酵素SOD活力最高。根據圖3所示，可以將最佳發酵時間設定為12 h。

2.1.4蔗糖添加質量分數的確定在3個發酵時長的條件下，當蔗糖添加質量分數小于5.3%時，隨著蔗糖添加質量分數的增加，麥苗酵素SOD活力均逐漸增加，在5.3%～6.7%之間保持相對穩定，之后隨蔗糖添加質量分數增加而下降。分析認為當蔗糖添加質量分數超過6.7%時，酵素液的滲透壓超過了酵母菌的滲透壓，細胞失水導致酶活下降。根據圖4所示，綜合成本考慮，將蔗糖添加體積分數設為5.3%。

圖3　發酵時間對麥苗酵素SOD活力的影響Fig.3　Effect of fermentation time on the activity of SOD in Barley ferment

圖4　蔗糖添加質量分數對麥苗酵素SOD活力的影響Fig.4　Effect of sucrose added on the activity of SOD in Barley ferment

2.1.5最終發酵工藝的確定根據以上實驗數據及分析，確定酵母菌發酵生產麥苗酵素的最佳工藝條件為：發酵溫度32℃，酵母接種體積分數0.67%，發酵時間12 h以及蔗糖添加質量分數5.3%。在此工藝條件下，測得麥苗酵素的SOD活力為（34.05±0.41）U/mL，實驗所用大麥苗勻漿液的SOD活力為（13.16±0.51）U/mL，向其中加入滅活酵母后其活力為（19.76±0.76） U/mL，相對于原料，酵母菌發酵麥苗酵素的活力分別提高了158.74%和72.32%，這意味著其營養價值得到了很大提升。

2.2　麥苗酵素抗氧化性能的初步研究

為了研究制得的麥苗酵素的抗氧化功能，除活力外，還對其CAT活力、總酚質量濃度以及羥基自由基清除率等抗氧化指標做了測定。

2.2.1麥苗酵素CAT活力CAT可促使H2O2分解，使細胞免受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一，也是麥苗酵素中一種重要的功效酶。對制得的麥苗酵素的CAT活力進行了測定，同時測定了實驗所用大麥苗勻漿液和添加了滅活酵母菌的大麥苗勻漿液作為對照。結果如表1。

從表1可以看出，制得的麥苗酵素的CAT活力比對照組A的CAT活力提高了98.71%，比對照組B的提高了67.75%。這表明通過酵母菌發酵，實驗制得的麥苗酵素的CAT活力既超過了實驗所用大麥苗勻漿液的CAT活力，也超過了實驗所用酵母菌（發酵前）與大麥苗勻漿液的CAT活力之和，發酵對于CAT酶活提高顯著。

表1　麥苗酵素CAT活力對比Table 1　Comparation of CAT Activity in barley ferment

2.2.2麥苗酵素總酚質量濃度多酚是在植物性食物中發現的具有潛在促進健康作用的化合物，其抗氧化功能可以對氧化損傷造成的慢性病起到預防作用，是麥苗酵素中的一種生物活性物質。對制得的麥苗酵素的總酚質量濃度進行了測定，同時測定了實驗所用大麥苗勻漿液和添加了滅活酵母菌的大麥苗勻漿液作為對照。結果如表2。

表2　麥苗酵素總酚質量濃度對比Table 2　Comparation of Total Phenol Content in barley ferment

從表2可以看出，制得的麥苗酵素的總酚質量濃度比對照組A的總酚質量濃度提高了82.57%，比對照組B的提高了16.88%。這表明通過酵母菌發酵，實驗制得的麥苗酵素的總酚質量濃度既超過了實驗所用大麥苗勻漿液的總酚質量濃度，也超過了實驗所用酵母菌（發酵前）與大麥苗勻漿液的總酚質量濃度之和，發酵對于總酚質量濃度提高顯著。

2.2.3麥苗酵素羥基自由基清除率羥基自由基（·OH）是一種重要的活性氧，從分子式上看是由氫氧根（OH-）失去一個電子形成，具有極強的氧化能力，是自然界中僅次于氟的氧化劑。羥基自由基清除率是反映物質抗氧化性能的一個重要指標。為研究麥苗酵素的抗氧化性能，對麥苗酵素的這項指標進行了測定，同時還測定了未加酵母菌且未滅菌的大麥苗勻漿液和添加了滅活酵母菌的大麥苗勻漿液作為對照。結果如表3。

表3　麥苗酵素羥基自由基清除率對比Table 3　Comparation of Hydroxyl radical scavenged of barley ferment

從上表可以看出，制得的麥苗酵素的羥基自由基清除率比對照組A的羥基自由基清除率提高了101.95%，比對照組B的提高了52.88%；且這一清除率水平達到了天然大麥酵素羥基自由基清除率的最高水平[17]；陽性對照的結果表明，該麥苗酵素的羥基自由基清楚能力介于8.0～9.0 mg/mL的抗壞血酸之間（分別為（48.27±0.35）%和（58.56±0.82）%）。這表明通過酵母菌發酵，實驗制得的麥苗酵素的羥基自由基清除率既超過了實驗所用大麥苗勻漿液的清除率，也超過了實驗所用酵母菌（發酵前）與大麥苗勻漿液的清除率，發酵后的麥苗酵素羥基自由基清除率提高顯著。

3　結　語

本文作者以大麥幼苗為原料，采用酵母菌進行發酵，得到了麥苗酵素產品。通過實驗研究得到一條大麥苗發酵生產麥苗酵素的工藝，確定了發酵工藝參數為：發酵溫度32℃，酵母接種體積分數0.67%，蔗糖添加質量分數5.3%，發酵12 h。此外，還對該產品的抗氧化功能進行了初步研究，其結果表明該產品的抗氧化功能較好，且較原料有了很大提升。本研究結果可為大麥的多功能開發利用以及酵素產品的研發和生產工藝的改進提供一定的支持。

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