可溶可逆聚合物Eudragit S-100對(duì)豬胰脂肪酶的固定化

袁久剛， 申 璇，　張慶娟， 余圓圓，　王 平， 王 強(qiáng)，　范雪榮

（1.江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.山東如意集團(tuán)，山東 濟(jì)寧 272000）

脂肪酶能在油水界面上催化酯水解、酯交換以及酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織以及日化等工業(yè)中[1-2]。然而受脂肪酶蛋白天然性質(zhì)的局限，這種催化劑在很多情況下不能滿足催化反應(yīng)的要求；另外，昂貴的價(jià)格、較低的回收利用性和催化穩(wěn)定性又使其在工業(yè)上的應(yīng)用受到極大限制。

固定化是脂肪酶改性常用的方法之一，通過固定化修飾，脂肪酶分子穩(wěn)定性得到大幅度提高，而且固定化脂肪酶極易與反應(yīng)物和產(chǎn)物分離，這使得反應(yīng)過程的可控性以及酶的重復(fù)利用性都得到提高，有助于降低成本[3-4]。目前，固定化常用的載體主要有吸附用的多孔性載體如大孔樹脂[5]、有機(jī)硅藻土[6]，包埋采用的海藻膠、卡拉膠等[7]，此外還有共價(jià)交聯(lián)采用的各種有機(jī)大分子載體如多糖類物質(zhì)等[8]。

這些載體及其固定化方法各有優(yōu)點(diǎn)，但是大部分固定化脂肪酶都是采用水不溶性載體，這導(dǎo)致催化反應(yīng)過程中底物與酶的接觸以及產(chǎn)物的擴(kuò)散都被限制，而對(duì)于可溶性大分子底物以及一些高分子聚合物的催化反應(yīng)，如動(dòng)物纖維脫脂，紡織品去污、廢棄滌綸的降解等，這種不溶性載體就會(huì)大大限制脂肪酶的催化效率。因此，若能尋找一種智能型的固定化載體，使其在催化反應(yīng)時(shí)處于溶解狀態(tài)，而在反應(yīng)結(jié)束時(shí)又可以通過改變某種條件使其不溶，便可以很好地解決這一問題。

Eudragit S-100便是這樣一種智能型的可溶可逆高分子聚合物。它主要由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚而成，其突出的優(yōu)點(diǎn)是溶解性可通過改變pH調(diào)節(jié)，在pH值高于5.5時(shí)溶解，pH值低于4.5時(shí)沉淀[9-10]。這種溶解-沉淀可逆特性使其在應(yīng)用于生物酶固定化時(shí)可表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，即：固定化改性酶可在溶解狀態(tài)下催化不溶性底物反應(yīng)，而反應(yīng)結(jié)束后，固定化酶又可以轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗軤顟B(tài)進(jìn)行回收。而且，EudragitS-100還具有無毒、相對(duì)價(jià)廉、與酶親和性等優(yōu)點(diǎn)。因此，將其作為酶的固定化材料具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。

以Eudragit系列樹脂為載體來制備固定化酶，可以通過吸附、包埋和共價(jià)結(jié)合的方法對(duì)酶進(jìn)行固定化。本文作者試圖利用共價(jià)結(jié)合的方法采用該樹脂對(duì)脂肪酶進(jìn)行固定化修飾。該研究有益于改善傳統(tǒng)固定化脂肪酶存在的異相催化效率低以及回收困難的特點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1　試劑與儀器

豬胰脂肪酶 （100-500 units/mg protein（using olive oil （30 min incubation），Sigma 公 司 產(chǎn) 品 ；Eudragit S-100，阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品；EDC，阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純級(jí)別。

Rapid恒溫振蕩水浴鍋，廈門瑞比公司產(chǎn)品；UV-1800紫外可見分光光度儀，日本島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；F-4600熒光分光光度儀，日本Hitachi產(chǎn)品；FA25高速攪拌器，上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司產(chǎn)品。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛋白質(zhì)含量的測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)[11]，采用考馬斯亮藍(lán)G-250（Bradford法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.2脂肪酶酶活測(cè)定按照江慧芳等人[12]的研究方法，以橄欖油聚乙烯醇乳化液作為底物，采用銅皂法進(jìn)行測(cè)定，其相對(duì)酶活定義為：

式（1）中，ER為相對(duì)酶活，E 為所測(cè)酶活值，Em為該組所測(cè)最大酶活值。

1.2.3Eudragit溶液配制將5 g Eudragit S-100粉末加入到70 mL蒸餾水中，用3 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 11，完全溶解后，用3 mol/L HCl溶液調(diào)pH 7.2，然后加蒸餾水定容至100 mL，得到5 g/dL的Eudragit S-100溶液。

1.2.4脂肪酶的固定化取一定量配制好的Eudragit S-100溶液，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液將其稀釋到 2%（W/V），加入 EDC（0.2 g/dL），在 30 ℃下磁力攪拌1 h，使Eudragit S-100分子上的羧基充分活化，然后向溶液中逐滴加入酶液，于恒溫振蕩器反應(yīng) 6 h（200 r/min），反應(yīng)結(jié)束后，用 0.5 mol/L 乙醇銨溶液滴定至pH=8，終止固定化修飾。最后用pH 7的Tris-鹽酸緩沖液（0.1 mol/L）定容至50 mL，得到溶解狀態(tài)下的Eudragit S-100共價(jià)修飾脂肪酶，于4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5平均氨基修飾率測(cè)定采用TNBS分光光度法進(jìn)行測(cè)試[13]。取2份各1 mL TNBS溶液，分別加入1.5 mL未修飾酶和固定化酶溶液，在室溫條件下靜置30 min，然后測(cè)定溶液在420 nm條件下的吸光度值。平均氨基修飾率按以下公式（2）計(jì)算：

式（2）中，X為平均氨基修飾率，A為修飾后蛋白質(zhì)溶液的吸光度值，A0為修飾前蛋白質(zhì)溶液的吸光度值。

1.2.6熒光光譜檢測(cè)采用F-4600熒光分光光度計(jì)，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描速度為12 000 nm/min，電壓400 V，響應(yīng)時(shí)間為0.1 s。測(cè)定脂肪酶在280～550 nm內(nèi)的發(fā)射光譜。

1.2.7修飾酶可逆可溶性測(cè)試修飾劑Eudragit S-100和其固定化修飾酶的溶解性會(huì)隨著溶液pH的改變而發(fā)生變化，具有可逆可溶性。參照Dourado等人[14]的方法，以溶液在470 nm下的吸光度值來表征修飾劑和修飾酶的溶解性。以溶質(zhì)完全不溶解時(shí)溶液的吸光度值為100%，溶質(zhì)完全溶解時(shí)溶液的吸光度值為0%。

1.2.8重復(fù)使用性能取一定量的修飾酶，邊攪拌邊滴加醋酸溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH至4.0，靜置30 min后離心，保留沉淀，沉淀用pH為4.0的緩沖溶液沖洗3次，洗滌后的沉淀溶解于pH為7.5的緩沖溶液，并定容至初始體積，然后測(cè)試該酶液的活力。重復(fù)該操作5次，視為重復(fù)使用修飾酶5次，以酶液的初始酶活為100%，計(jì)算每次使用時(shí)修飾酶的相對(duì)酶活。

2　結(jié)果與討論

2.1　Eudragit S-100對(duì)脂肪酶的平均氨基修飾率

蛋白質(zhì)中的游離氨基可以與還原糖的醛基末端發(fā)生羰胺縮合反應(yīng)，從而使游離態(tài)的氨基成為結(jié)合態(tài)，因此，采用TNBS法可以測(cè)得脂肪酶經(jīng)過Eudragit S-100固定化修飾后的平均氨基修飾率。對(duì)不同固定化時(shí)間下的修飾脂肪酶進(jìn)行TNBS分光光度法測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)氨基修飾率的影響（反應(yīng)溫度15℃）Fig.1　Effect of reaction time on modification rate of free amino（reaction temperature 15 ℃）

從圖1可以明顯看出，脂肪酶中的氨基確實(shí)與Eudragit S-100樹脂中的羧基進(jìn)行了反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了在Eudragit S-100上的固定化。另外，從圖中也可以看出：當(dāng)時(shí)間較短時(shí)，Eudragit S-100不能對(duì)豬胰脂肪酶進(jìn)行有效的固定化修飾，因此其氨基修飾率較低。隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪酶的平均氨基修飾率也逐漸提升，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行6 h后，Eudragit S-100固定化脂肪酶的平均氨基修飾率達(dá)到52.4%，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，其氨基修飾率并未有較大幅度提升。這主要是由于蛋白質(zhì)的空間位阻以及Eudragit S-100本身含有的活化羧基數(shù)目有限，使得脂肪酶中能夠參與修飾的游離氨基已經(jīng)全部參與反應(yīng)，因此，其平均氨基修飾率不再發(fā)生變化。

2.2　固定化修飾對(duì)脂肪酶構(gòu)象的影響

在天然蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中，酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）在280 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下會(huì)發(fā)射熒光，而固定化修飾劑Eudragit S-100則沒有熒光特性，因此根據(jù)溶液的熒光光譜特征，可以分析蛋白結(jié)構(gòu)的變化[15]。對(duì)不同時(shí)間固定化修飾后的脂肪酶進(jìn)行熒光光譜檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，在280 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，原酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)為343 nm，一般認(rèn)為該內(nèi)源熒光來源于色氨酸殘基。經(jīng)過固定化的脂肪酶則在345～346 nm處有熒光吸收，其強(qiáng)度也發(fā)生了變化，通常認(rèn)為這是由于固定化修飾導(dǎo)致脂肪酶構(gòu)象發(fā)生變化所致。熒光發(fā)射光譜紅移，說明原來位于酶分子內(nèi)部的色氨酸殘基向酶分子表面發(fā)生了遷移[16]；而峰強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)，說明在修飾過程中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪酶的蛋白結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，最初蛋白結(jié)構(gòu)被拉伸、展開，使得色氨酸殘基暴露數(shù)量先增加，峰強(qiáng)度變大，而后隨著正確折疊，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變得緊湊，氨基酸暴露數(shù)量也減少，最終導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[17]。但是，折疊程度過大不利于脂肪酶酶活的表達(dá)，因此，結(jié)合圖1中的氨基修飾率可以看出，固定化修飾時(shí)間不易過長(zhǎng)。

圖2　不同反應(yīng)時(shí)間下原酶與固定化脂肪酶的熒光光譜Fig.2　Fluorescence　spectra　of　native　lipase　and immobilized lipase after different reaction time

2.3　固定化修飾對(duì)脂肪酶最適溫度的影響

溫度對(duì)酶的催化反應(yīng)影響極大，只有在最適溫度下，酶的催化活力才能得到最大程度的發(fā)揮。對(duì)不同溫度下游離脂肪酶和固定化修飾脂肪酶的酶活力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

圖3　固定化修飾對(duì)脂肪酶最適溫度的影響Fig.3　Effectofimmobilization　on　the　optimum temperature of lipase

從圖3可以發(fā)現(xiàn)，Eudragit S-100固定化修飾前后脂肪酶的最適溫度均為40℃左右，固定化修飾對(duì)脂肪酶的最適溫度并沒有造成很大影響。但是從實(shí)際的絕對(duì)酶活力也可以看出，除了降低脂肪酶在最適溫度條件下的酶活外，固定化脂肪酶在其它溫度條件下都較游離脂肪酶有更高的絕對(duì)酶活力，尤其是在較低反應(yīng)溫度條件下，固定化修飾后的脂肪酶比游離脂肪酶有更高的水解活力。造成這種現(xiàn)象的原因可能是：固定化修飾后，脂肪酶與Eudragit S-100載體進(jìn)行了多點(diǎn)共價(jià)連接，可以有效防止酶分子伸展變形，提高了脂肪酶對(duì)外界溫度變化的適應(yīng)性。

2.4　固定化修飾對(duì)脂肪酶最適pH的影響

對(duì)不同pH下游離脂肪酶和Eudragit S-100固定化脂肪酶的酶活分別進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖4所示。

圖4　固定化修飾對(duì)脂肪酶最適pH的影響Fig.4　Effect of immobilization on the optimum pH of lipase

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，無論是游離脂肪酶還是固定化脂肪酶，隨著pH的逐漸增加，酶活均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)。在酸性條件下游離脂肪酶的酶活較低，而在堿性條件下酶活迅速增大并在pH為7.5～8.0時(shí)酶活達(dá)到最大值，這與豬胰脂肪酶的堿性水解特性非常相符。固定化后脂肪酶的最適反應(yīng)pH也在7.5～8.0之間，相比于游離脂肪酶，其最適pH值向堿性方向略有移動(dòng)，這主要是由于Eudragit S-100樹脂本身為陰離子性物質(zhì)，因此與其結(jié)合后，脂肪酶的微環(huán)境發(fā)生了變化，導(dǎo)致其最適pH值發(fā)生了變化[18-19]。

2.5　固定化脂肪酶的可溶可逆性

Eudragit S-100本身具有pH響應(yīng)的可逆可溶性，但是當(dāng)Eudragit作為載體與脂肪酶共價(jià)連接后，形成的固定化修飾酶能否保留Eudragit的可逆可溶性，其響應(yīng)pH范圍會(huì)否發(fā)生改變，對(duì)于脂肪酶的催化以及回收都有重要影響。本文參照Yu Yuanyuan等人[20]的方法對(duì)Eudragit S-100固定化脂肪酶的可逆可溶性進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖5所示。

圖5　固定化脂肪酶的可溶可逆性Fig.5　Reversible solubility of immobilized lipase

從圖5中可以看出，當(dāng)溶液pH大于5.5時(shí)，Eudragit S-100和固定化修飾酶溶液在470 nm處的吸光度均為0%，說明此時(shí)修飾劑與固定化脂肪酶均能完全溶解；而當(dāng)溶液pH低于4時(shí)，所有溶液的吸光度值達(dá)到最大值，此時(shí)修飾劑與修飾酶均已完全沉淀。另外，從圖中可以看出，Eudragit S-100與酶共價(jià)交聯(lián)后，其溶解度的pH變化范圍向pH大的方向發(fā)生了移動(dòng)。這是因?yàn)镋udragit S-100自身是酸性的，當(dāng)其與酶發(fā)生共價(jià)連接后，結(jié)構(gòu)中的自由羧基數(shù)目減少，從而導(dǎo)致溶解度的pH變化范圍向pH大的方向移動(dòng)。總體來看，脂肪酶與Eudragit S-100進(jìn)行固定化修飾后，樹脂的可溶可逆性沒有被破壞，而且其pH響應(yīng)范圍也介于脂肪酶最適pH以下，對(duì)于脂肪酶的催化水解以及回收都不會(huì)造成太大影響。

2.6　固定化脂肪酶的可重復(fù)使用性

將固定化修飾酶溶液的pH調(diào)節(jié)至4.0，修飾酶會(huì)沉淀析出。利用該性質(zhì)，可以回收使用固定化酶。對(duì)不同次數(shù)回收后的固定化脂肪酶活力進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖6所示。Fig.6Reuse of immobilized lipase

圖6　固定化脂肪酶的可重復(fù)使用性

從圖6可以看出，Eudragit S-100固定化修飾脂肪酶在一次使用后，其脂肪酶酶活力的保留率約為92%，經(jīng)過5次重復(fù)使用后，脂肪酶酶活力的保留率仍為45%，表現(xiàn)出較好的重復(fù)使用性能。在重復(fù)使用過程中出現(xiàn)酶活損失的主要原因如下：首先，酶在每次回收過程中無法確保100%回收，沉淀以及沖洗過程會(huì)損失一部分酶；其次，在回收過程中，反復(fù)調(diào)節(jié)溶液的pH值改變酶的狀態(tài)，可能會(huì)對(duì)酶的活性部位產(chǎn)生影響，導(dǎo)致部分酶失活；最后，酶在使用過程中需要在40℃條件下進(jìn)行，長(zhǎng)時(shí)間處于此溫度也會(huì)導(dǎo)致部分酶失活。

3　結(jié)　語

從以上分析可以看出，活化后的可溶可逆載體Eudragit S-100能夠成功用于豬胰脂肪酶的固定化修飾，固定化修飾之后，豬胰脂肪酶與載體進(jìn)行了多點(diǎn)共價(jià)交聯(lián)，而且經(jīng)過有序折疊，分子結(jié)構(gòu)變得較為緊湊，這導(dǎo)致固定化酶具有較好的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，但是酶活有一定損失。同時(shí)，固定化之后的脂肪酶保留了原載體pH響應(yīng)的可溶可逆性，能夠比較方便的從溶液中進(jìn)行回收，并且具有一定的重復(fù)使用性能。

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