熱處理對生鮮乳及復原乳蛋白質體外消化特性的影響

姜竹茂，劉 曉,，張書文，逄曉陽，劉 鷺，蘆 晶,*，呂加平,*

牛乳經過均質、滅菌、濃縮、噴霧干燥等工藝加工成乳粉，乳粉又可用作嬰幼兒配方奶粉及其他食品配料[1]，在用作食品配料時（如制作配方奶粉、復原乳、酸奶等）將再次經過加熱溶解、高溫殺菌及噴霧干燥等多次熱處理。熱處理加工可殺滅牛乳中的微生物，保證牛乳質量安全，并使牛乳獲得特殊風味[2]。另外，熱處理會對牛乳品質造成不良影響，如牛乳中許多熱敏營養成分會受到破壞，且隨著受熱強度的增加，牛乳會出現pH值降低、磷酸鈣沉淀，蛋白質變性、維生素損失以及美拉德反應加劇[3]，影響牛乳的營養價值[4]。因而，引發了復原乳與鮮牛乳之爭，如此對奶粉進行反復加熱處理，對產品營養價值及食用品質到底產生了哪些影響，缺乏從微營養組及微觀結構進行系統深入的比較研究。

與牛乳中的脂肪和碳水化合物相比，蛋白質對熱處理更敏感，加熱處理會造成乳蛋白變性或與碳水化合物等其他成分相互作用而發生成分結構和性質變化[5-6]。現已證實，熱處理會導致牛乳蛋白質的消化性產生變化[7]。另外，蛋白質還可與乳中還原性糖發生美拉德反應，對牛乳的營養價值產生不良影響。為了研究熱處理程度及加熱次數對乳蛋白質的影響，本實驗以鮮牛乳與復原乳為研究對象，通過加熱或不加熱處理后，對其進行蛋白質體外消化，然后采用電泳及組學等分析技術，對牛乳蛋白質的消化性、美拉德反應產物及程度進行研究，為乳品營養評價及優化加工工藝提供參考[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛乳 北京三元集團下屬奶牛場；乳粉市售；α-淀粉酶、溶菌酶、黏蛋白、牛血清蛋白、胃蛋白酶、胰液素、膽鹽、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）美國Sigma公司；氯化鈣、磷酸二氫鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；四甲基乙二胺 美國AMResco公司；考馬斯亮藍R250北京廣達恒益有限公司；蛋白質Marker 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2300型紫外-可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司；TS-1脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；MVS-1旋渦混合器 北京金北德工貿有限責任公司；SC-15數控超級恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；3K-15離心機 美國Sigma公司；DELTA 320 pH計 瑞士梅特勒-托利多股份有限公司；BSA 124S-CW分析天平 上海精密科學儀器有限公司；EPS301電泳儀 美國GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品1鮮牛乳樣品：購于牛場鮮牛乳，未經任何加工處理；樣品2復原乳樣品：乳粉用水溶解，使其蛋白質含量與鮮牛乳蛋白質含量相同；樣品3加熱鮮牛乳樣品：鮮牛乳95 ℃，加熱處理2 min；樣品4加熱復原乳樣品：復原乳溶液95 ℃，加熱處理2 min。

1.3.2 蛋白質含量的測定

參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》[11]。

1.3.3 體外模擬蛋白質消化[12]

1.3.3.1 消化液的配制

食物進入胃部后由胃蛋白酶將食物中的蛋白質分解成大肽段，進入小腸后，由胰腺分泌的胰蛋白酶分解成小分子肽和少量游離氨基酸。因此，體外模擬消化液主要分為唾液消化液、胃液、胰液及膽汁，各消化液組成見表1[13-15]。

表1 模擬消化液組分Table 1 Compositions of simulated digestive juices

1.3.3.2 體外模擬胃部消化

取熱處理牛乳樣品及未加工鮮牛乳各2.25 mL，加入唾液消化液3 mL，37 ℃保溫5 min。然后取6 mL的胃液加入上述消化樣品中，在37 ℃條件下振搖120 min。

1.3.3.3 體外模擬腸液消化

向胃消化后的樣品同時加入6 mL的胰液和3 mL的膽汁，37 ℃振搖120 min。消化后的樣品要盡快放入－80 ℃的冰箱凍存，以防樣品變質，影響實驗備用。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）[16-17]

樣品取自鮮牛乳、復原乳、熱處理樣品以及在胃液消化和腸液消化后的各個樣品進行電泳，分離大于5 kDa的蛋白。使用12%分離膠。電泳所用Marker分子質量范圍在14.4～94 kDa之間。

為了測定樣品的蛋白含量，將樣品稀釋，最終確定所有的樣品蛋白含量相同，與上樣緩沖液等量混合，沸水浴3～5 min，離心2 min，取10 μL樣品進行上樣，電泳結束后，凝膠用考馬斯亮藍染色液進行染色1 h，再用脫色液進行脫色至條帶清晰為止。

1.3.5 蛋白消化率的測定[18]

牛乳經過凝膠電泳后，測定各蛋白電泳條帶灰度值，根據公式（1）計算蛋白消化率：

1.3.6 消化樣品的肽段分布測定[19]

消化的樣品用濾管離心過濾，經10 248 r/min離心30 min，取濾液，用尺寸排阻色譜柱分離，并進行分析，其中色譜標準品分子質量的選擇要包含所有樣品肽段的分子質量。BioBasic SEC-300色譜柱（7.8 mm×150 mm）；緩沖液A：50%水-50%乙腈-0.1%甲酸；流速0.5 mL/min，在波長214 nm處色譜分離并檢測。

1.3.7 掃描電鏡觀察乳蛋白膠粒[20]

2 mL牛乳樣品于10 ℃、5 000 r/min離心10 min脫脂。取500 μL脫脂后的牛乳樣品與等體積的1.4%戊二醛溶液混合，混勻后在4 ℃的冰箱靜置4～6 h。取1 mL的固定液用0.02 mol/L CaCl2溶液稀釋到100 mL。將稀釋后的樣品涂抹在蓋玻片上，滴加95%乙醇溶液脫水干燥，黏貼在金屬臺上噴金，用掃描電鏡觀察樣品。

1.3.8 美拉德反應程度及反應產物[21]

取一定量的牛乳樣品于10 ℃條件下5 000 r/min離心10 min脫脂，并測定蛋白濃度。

1.3.8.1 蛋白酶解反應

取含有1 mg蛋白的樣品加入終濃度為5 mmol/L的DTT，56 ℃保溫30 min；樣品冷卻后再加入終濃度為10 mmol/L的IAA（50 mmol/L NH4HCO3溶液），室溫避光30 min；然后加入終濃度為5 mmol/L的DTT，室溫避光15 min；樣品反應完后按胰蛋白酶與蛋白質為1∶100的質量比加入胰蛋白酶，在37 ℃條件下消化4 h。最后加入10 倍稀釋的三氟乙酸溶液若干，將該溶液的pH值調整為2.0即可，冷凍干燥。

1.3.8.2 糖蛋白富集反應

將1 mL間氨基苯硼酸瓊脂糖裝入層析柱中，用平衡液平衡層析柱。將600 μg酶解肽段溶于200 μL平衡液中，在4 ℃條件下加到層析柱中，靜置1 h。用5 mL醋酸溶液洗脫糖基化肽段，分裝為5 份，于－80 ℃冰箱中保存，待測。

1.3.8.3 質譜分析美拉德反應肽段

利用超高效液相色譜-二級質譜測定發生美拉德反應肽段。利用MaxQuant蛋白質組學分析軟件解析發生美拉德反應的賴氨酸位點及其所在肽段和蛋白質。美拉德反應程度=美拉德反應肽段峰度值/樣品測定肽段豐度總和。

1.3.9 糠氨酸含量的測定

根據NY/T 939—2005《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》的高效液相色譜法，在波長280 nm處對糠氨酸進行定性定量檢測。流動相A為0.1%三氟乙酸溶液，流動相B為甲醇。洗脫條件如表2所示。

表2 高效液相色譜梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of HPLC

糠氨酸含量按公式（2）計算：

式中：w為樣品中每100 g蛋白質中糠氨酸的含量/（mg/100 g）；b為樣品水解液中糠氨酸質量濃度/（μg/mL）；D為測定時樣品稀釋倍數（D=6）；m為樣品水解液中蛋白質質量濃度/（mg/mL）。

標準曲線的測定：以糠氨酸標準樣品配制成200 μg/mL的糠氨酸標準貯備液，然后配制成質量濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/mL的標準液，采用高效液相色譜測定其峰面積，并繪制標準曲線。將樣品的峰面積代入標準曲線后，即可求得樣品糠氨酸含量。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE測定結果

如圖1所示，鮮牛乳、復原乳、加熱鮮牛乳及加熱復原乳4 個樣品經過胃液消化后（A-2、B-2、C-2、D-2），其中鮮牛乳酪蛋白條帶灰度值小于其他3 組樣品，說明在4 組樣品中鮮牛乳的酪蛋白于胃液中消化程度最高。而經胃液消化后β-乳球蛋白及α-乳白蛋白仍存在大量殘留，說明在胃液消化階段，仍有大量完整β-乳球蛋白及α-乳白蛋白未被消化。對比4 個樣品的腸液消化樣品（A-3、B-3、C-3、D-3），各樣品的蛋白條帶基本被消化完全，4 個樣品間差異不明顯。說明牛乳樣品經過胃液后可消化部分蛋白，其中酪蛋白消化程度較大，而在腸液消化中，蛋白質基本消化完全。

2.2 不同消化階段各樣品蛋白質消化率

從圖2A可以看出，經過胃液消化，鮮牛乳樣品中酪蛋白的消化率最高，鮮牛乳中3 種酪蛋白均達到50%以上，且均顯著高于其他3 個樣品（P＜0.05）。鮮牛乳中β-乳球蛋白與α-乳白蛋白經胃液消化后，消化率較其他3 個樣品低。由圖2B可知，經過腸液消化后，蛋白質消化程度較胃消化階段顯著提高，特別是β-乳球蛋白與α-乳白蛋白，均被消化完全，且4 個樣品無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 不同熱處理乳蛋白的胃消化率（A）和腸液消化率（B）Fig. 2 Gastric (A) and intestinal (B) digestibility of different heat-treated milk proteins

2.3 消化樣品肽的分布

圖3 不同熱處理樣品胃消化（A）和腸消化（B）后肽段分子質量Fig. 3 Molecular weight distribution of peptides in different heat-treated samples after intestinal digestion

根據肽段分子質量不同，利用體積排阻色譜法測定牛乳樣品中肽段分子質量的分布情況[22-23]。由圖3A可知，4 個樣品經過胃液消化后，蛋白質在蛋白酶的作用下分解成大分子肽段和游離氨基酸，各樣品肽段分子質量在6 000 Da以上的比例較大，其中在大于6 000 Da分子質量范圍內，鮮牛乳胃消化樣品中百分比顯著低于其他3 個樣品（P＜0.05）。說明胃消化后，鮮牛乳中的殘留蛋白及大分子肽的含量較其他3 個樣品少，消化效果優于其他3 組樣品，此結果與電泳及消化率測定結果一致。由圖3B可知，經過胃液消化的各組蛋白質樣品再經腸液的進一步消化后的肽段分子質量主要在1 500 Da以內，主要集中在300～1 500 Da，即由大約2～12 個氨基酸組成的小分子肽段，而該分子質量大小的肽片段更容易被吸收[24]。但4 個樣品在此分子質量區間肽段的分布比例彼此差異不顯著（P＞0.05）。4 個樣品腸液消化后在300～1 500 Da的肽段的含量較胃液消化階段明顯提高，說明腸道是蛋白質實現完全消化及吸收的主要階段。

2.4 掃描電鏡觀察蛋白形態變化

圖4 蛋白變化程度的掃描電鏡圖（×15 000）Fig. 4 SEM images of protein denaturation (× 15 000)

在相同倍數條件下掃描電鏡觀察4 種樣品，如圖4所示。與復原乳相比，鮮牛乳樣品的蛋白質呈現分散狀態，極少存在蛋白凝聚現象。鮮牛乳經加熱后，蛋白質由于變性出現聚集，且不同樣品的凝聚程度不同。4 個樣品中，加熱復原乳樣品在電鏡下蛋白粒徑最大，4 種樣品中凝聚程度最高。這是由于牛乳在加工成乳粉的過程中，需經過多次熱處理，其熱處理的次數與程度高于其他樣品，變為復原乳后再經過熱處理，蛋白變性程度較其他3 個樣品高，蛋白凝聚形成較大的蛋白顆粒[25-26]，蛋白變性聚集成大顆粒團狀也將抑制胃液對蛋白的消化效果。

2.5 熱處理對糠氨酸含量的影響

圖5 樣品中糠氨酸的含量Fig. 5 Furosine contents in milk samples

如圖5所示，鮮牛乳中糠氨酸含量顯著低于其他3 個樣品（P＜0.05）。鮮牛乳、加熱鮮牛乳、復原乳及加熱復原乳樣品中糠氨酸含量依次增加，彼此差異顯著（P＜0.05）。糠氨酸是美拉德反應初期的標志性產物[27]，其含量與美拉德反應的程度呈正相關，樣品中糠氨酸含量越高，表明樣品的美拉德反應程度較大[28]。與鮮牛乳相比，復原乳及加熱復原乳因受到多次熱處理，其蛋白質美拉德反應程度較大，糠氨酸含量也較高。

2.6 不同樣品美拉德反應程度及反應肽段

利用超高效液相色譜-二級質譜聯用技術分析乳中蛋白質發生美拉德反應位點及程度。4 種樣品中發生美拉德反應的蛋白質主要為酪蛋白及α-乳白蛋白。如圖6所示，加熱復原乳的美拉德反應程度最高，其次是復原乳、加熱鮮牛乳及鮮牛乳。與圖5結果一致，說明熱處理程度越大，乳蛋白發生美拉德反應程度越高。美拉德反應影響蛋白質賴氨酸的利用率同時影響功能性肽段的釋放[29-30]。

圖6 美拉德反應程度Fig. 6 Degree of Maillard reaction in milk samples

3 結 論

本實驗從體外模擬蛋白消化、蛋白粒徑及美拉德反應等方面進行研究。結果表明，經過胃液消化后，牛乳中部分蛋白被消化，其中酪蛋白消化較為明顯，而腸液消化后，蛋白基本消化完全，說明主要消化場所在腸道中。鮮牛乳中酪蛋白在胃液中消化水平較其他熱處理樣品高。經過胃液消化后，大分子蛋白分解，生成6 000 Da以上的肽段，腸液消化后，大分子蛋白主要分解成小分子肽段及游離氨基酸，其肽段分子質量主要在300～1 500 Da之間。熱處理過程使蛋白質發生聚集反應，熱處理程度越大，蛋白粒徑越大，說明溫度越高，蛋白變性聚集，粒徑越大。熱處理使蛋白發生美拉德反應，溫度越高，時間越長，美拉德反應越劇烈。

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