離子強度對大豆11S球蛋白表面疏水性及結構的影響

齊寶坤，江連洲，王 歡，李 楊*

大豆蛋白不僅具有高營養價值，而且功能特性良好，常被應用于食品加工中[1]。大豆11S球蛋白是構成大豆蛋白的組分，由酸性亞基（A亞基）和堿性亞基（B亞基）組成，分子質量為300～380 kDa，以疏水性六聚體的形式存在，具有一定的剛性。酸性亞基和堿性亞基交互對應形成比較穩定的結構形式，通過二硫鍵連接而成[2]，氫鍵和靜電作用對大豆11S球蛋白整體結構的穩定具有重要的貢獻。蛋白質分子和鹽離子之間的相互作用是從分子水平上控制溶液中蛋白質的結構和功能性質，鹽離子會使大豆蛋白溶液中離子-偶極和離子-離子之間的相互作用發生改變，從而使大豆蛋白的結構發生變化[3-5]。研究鹽離子對蛋白質的空間結構和溶液性質的影響，有助于理解、設計和優化蛋白質在兩相體系的分離以及蛋白質表達等與蛋白相關的生產加工過程。李向紅等[6]研究離子強度對大豆分離蛋白熱誘導聚集體的影響，研究表明離子的引入對大豆分離蛋白的表面電荷產生影響，電荷屏蔽作用使分子間靜電斥力降低，促進了高離子強度條件下聚集體的產生。Mills等[7]研究指出大豆蛋白聚集體結構隨環境中離子強度的升高發生明顯改變。多數研究集中在離子強度對大豆分離蛋白功能特性的影響，而離子強度對大豆11S球蛋白空間結構、溶液性質和表面疏水性（H0）影響的研究鮮有報道。本實驗對不同離子強度條件下大豆11S球蛋白溶解性、H0、Zeta電位、粒徑進行測定，同時采用拉曼光譜技術對蛋白質的分子結構進行分析，探討離子強度對大豆11S球蛋白H0及結構的影響，找尋不同離子強度條件下大豆11S球蛋白結構與H0的內在聯系。在實際生產中，通過調整加工工藝條件對大豆蛋白產品實施定向操控，有效改善大豆蛋白的功能特性，為今后開發高穩定性和高功能性大豆蛋白、提高大豆蛋白的生產利用率提供重要的理論指導和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東農46大豆，東北農業大學大豆研究所。

8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonate，ANS） 美國Sigma公司；Lowry法蛋白質含量測定試劑盒 上海荔達生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Allegra X-15R低溫高速離心機 美國Beckman公司；AKTA-蛋白質純化儀 美國GE公司；F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司；ZetaPALS-Zeta電位儀、ZetaPALS-激光粒度分析儀 美國布魯克海文儀器公司；Raman Station 400拉曼光譜儀 美國PE公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆11S球蛋白的制備

參考Nagano等[8]的方法。

大豆→脫皮→粉碎→過60 目篩→正己烷脫脂→脫脂大豆粉→與水混合（料液比1∶15（g/mL））→調節pH 7.5→提取2 h→離心分離（10 000×g，15 min）→上清液→添加亞硫酸鈉（0.98 g/L）→提取1 h→調節pH 6.4→4 ℃過夜→離心分離（12 000×g，20 min）→沉淀→凍干→大豆11S球蛋白粗提物。

應用AKTA-蛋白質純化儀和HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade凝膠制備級預裝柱，對大豆11S球蛋白粗提物進行純化，并進一步采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白質組成，通過光密度掃描測得大豆11S球蛋白純度約為92%。

1.3.2 不同離子強度緩沖溶液的配制

向pH值為7.6、0.01 mol/L的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液中添加不同質量濃度的NaCl溶液，配制離子強度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.9的緩沖溶液，將配制好的緩沖液用0.45 μm水相濾膜過濾。在緩沖溶液的配制過程中，經測定離子強度有0.01的誤差，可以忽略不計。

1.3.3 溶解性的測定

參考Samoto等[9]的方法。稱取100 mg大豆11S球蛋白樣品分散于10 mL的去離子水中，磁力攪拌30 min后，12 000×g離心20 min。上清液經適度稀釋，采用Lowry法測定稀釋后的上清液中蛋白質的含量，以牛血清白蛋白為標準物制作標準曲線。蛋白質的溶解度表示為上清液中蛋白質量與樣品中總蛋白質量的比值。溶解性按下式計算：

1.3.4 H0的測定

采用ANS熒光探針法測定蛋白質H0[10]。將大豆11S球蛋白樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中配成10 mg/mL的蛋白溶液，室溫條件攪拌1 h后在10 000×g條件下離心30 min，上清液用相同的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.07～0.67 mg/mL（采用Lowry法測定蛋白濃度）。分別取不同質量濃度的樣品溶液4 mL，加入8 mmol/L的ANS溶液40 μL，充分振蕩混勻后靜置3 min，測定樣品的熒光強度。激發波長（λEx）為390 nm，發射波長（λEm）為470 nm，夾縫寬均為5 nm。以蛋白質質量濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，曲線初始斜率即為蛋白質的H0。

1.3.5 Zeta電位的測定

根據Zhao Chengbin等[11]的測定方法，采用ZetaPALSZeta電位儀測定大豆11S球蛋白溶液的Zeta電位。將11S球蛋白樣品用緩沖液稀釋至質量分數為0.2%，上樣體積為1 mL。Zeta電位測定條件：聚苯乙烯池（1 cm）若干，鉑電極（0.45 cm2，間距0.4 cm）一對。溫度為25 ℃，溫度平衡時間為2 min。

1.3.6 粒徑分布的測定

根據李楊等[12]的測定方法，采用ZetaPALS-激光粒度分析儀測定大豆11S球蛋白的平均粒徑分布。將11S球蛋白樣品用磷酸緩沖液稀釋至蛋白質量分數為0.2%的溶液。過0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜，室溫條件下測量。

1.3.7 拉曼光譜的測定

參考張萍等[13]的測定方法，將大豆11S球蛋白用緩沖溶液配制成質量濃度為100 mg/mL的溶液進行拉曼測定。激發光波長設定為785 nm，激光功率為300 mW，掃描范圍為400～2 000 cm－1，每次掃描時間60 s，積分10 次，4 次掃描進行累加。拉曼圖譜處理：譜圖基線校正、譜峰查找采用ACD Labs V12軟件，以苯丙氨酸（1 003±1）cm－1作為歸一化因子，以此作為各拉曼峰強度變化的依據，得到不同條件下大豆11S球蛋白的拉曼光譜，采用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件計算大豆11S球蛋白各結構的含量。

1.4 統計分析

每個樣品重復3 次實驗，ANOVA差異顯著性分析利用SPSS V17.0軟件完成，P值小于0.05為顯著性差異，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 離子強度對大豆11S球蛋白溶解性和H0的影響

圖1 離子強度對大豆11S球蛋白溶解性和H0的影響Fig. 1 Effect of ionic strength on the solubility and surface hydrophobicity of 11S glycinin

由圖1可以看出，與未添加鹽離子的大豆11S球蛋白相比，添加鹽離子會使大豆11S球蛋白溶解性降低；隨著離子強度的升高，大豆11S球蛋白的溶解性進一步降低，表現為“鹽析”效應。出現這種現象的原因主要包括2 個方面：一是鹽離子與環境中的水分子相互作用使大豆11S球蛋白與水分子相互作用相對減少，球蛋白分子表面的親水基團與水分子之間的相互作用力減弱，這種鹽離子與蛋白質分子之間的競爭性水合促使蛋白質分子間碰撞幾率增加，使蛋白質分子間發生聚集，導致溶解性降低；另一方面是由于鹽離子的引入屏蔽了蛋白質分子表面的電荷，減弱了蛋白質分子間靜電排斥作用[14]，使溶液穩定性下降，蛋白分子之間通過疏水相互作用發生聚集，這也是導致溶解性降低的重要原因。

與未添加鹽離子的大豆11S球蛋白相比，添加鹽離子會使大豆11S球蛋白H0增加；隨著離子強度的升高，大豆11S球蛋白的H0進一步增加。在水溶液中大豆11S球蛋白分子內各種極性基團之間的氫鍵和靜電相互作用不具備足夠能量驅動蛋白分子發生折疊，蛋白質分子內非極性基團的疏水相互作用是驅動蛋白發生折疊的主要作用力，但是疏水相互作用不穩定，環境極性的改變會對疏水相互作用產生重要的影響。鹽離子的添加使蛋白質的外部環境發生改變，破壞了蛋白質分子間的疏水相互作用[15]，導致蛋白質空間結構變的松散，疏水性氨基酸殘基暴露于蛋白質分子表面，從而使H0升高[16]。

2.2 離子強度對大豆11S球蛋白Zeta電位和平均粒徑的影響

圖2 離子強度對大豆11S球蛋白Zeta電位和平均粒徑的影響Fig. 2 Effect of ionic strength on Zeta-potential and average particle size of 11S glycinin

鹽離子的引入可以使蛋白溶液中帶電微粒周圍的電荷分布情況受到影響，致使大豆11S球蛋白溶液的Zeta電位發生改變。由圖2可以看出，與未添加鹽離子的大豆11S球蛋白相比，添加鹽離子會使大豆11S球蛋白Zeta電位絕對值降低，這可能是由于鹽離子的引入會使蛋白質分子表面的陽離子數量增多，引起大豆球蛋白分子表面擴散雙電層被壓縮，由于鹽橋的作用，蛋白質內外的靜電平衡會被打破，從而導致Zeta電位絕對值降低[17]。隨著離子強度的增加，大豆11S球蛋白溶液的Zeta電位絕對值進一步降低，這也說明鹽離子能夠屏蔽大豆蛋白表面的電荷。張輝[18]研究了離子強度對大豆分離蛋白Zeta電位的影響，表明離子強度增加能夠使大豆蛋白表面電荷受到屏蔽作用，這與本實驗的研究結果一致。

H0是衡量蛋白質疏水作用的重要指標，而疏水作用是蛋白質聚集現象的主要作用力，這種聚集在一定程度上影響了蛋白質分子的平均粒徑分布[19]。由圖2可以看出，與未添加鹽離子的大豆11S球蛋白相比，添加鹽離子會使大豆11S球蛋白形成尺寸更大的顆粒。當離子強度從0.1升高至0.9時，大豆11S球蛋白的平均粒徑也從130.2 μm增加至196.3 μm。這可能是由于隨著離子強度的增加，環境中與大豆11S球蛋白分子競爭水合的鹽離子越來越多，使得蛋白質與水分子間的相互作用減弱，球蛋白分子間的碰撞幾率增加，球蛋白分子可能通過分子間的疏水相互作用和靜電相互作用等聚集形成具有較大粒徑的可溶性聚集物[20]。

結合溶解性和H0分析可知，大豆11S球蛋白是一種疏水基團包埋于分子內部，親水基團暴露于分子外部的球狀蛋白質，離子強度的升高引起靜電屏蔽作用的增加，使蛋白質分子間的靜電排斥力降低，從而促進蛋白質分子聚集[21]。同時高離子強度條件下蛋白分子的球狀結構變得松散，分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露出來，導致大豆11S球蛋白的溶解性降低、H0增加。

2.3 不同離子強度條件下大豆11S球蛋白的拉曼光譜分析

拉曼光譜不僅可以提供蛋白質主鏈二級結構信息，同時還可以提供側鏈的結構信息，尤其是色氨酸、酪氨酸微環境變化的信息[22]。如圖3所示，由于拉曼光譜圖中特征峰的強度與蛋白質中特定基團或化學鍵的數目成正比，如果特征峰的強度發生改變，則說明蛋白質分子中特性基團和化學鍵的數目發生了改變[23]。

圖3 不同離子強度條件下大豆11S球蛋白的拉曼光譜圖Fig. 3 Raman spectra of 11S glycinin at different ionic strengths

2.3.1 不同離子強度條件下大豆11S球蛋白二級結構分析

表1 酰胺I帶擬合不同離子強度條件下大豆11S球蛋白二級結構含量Table 1 Secondary structure contents of 11S glycinins determined by curve fitting of Amide I bands at different ionic strengths%

采用Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件對大豆11S球蛋白的拉曼圖譜二級結構進行定量計算，利用酰胺I帶擬合不同離子強度條件下大豆11S球蛋白二級結構含量，結果如表1所示。隨著離子強度的增加，大豆11S球蛋白二級結構中α-螺旋含量顯著降低，β-折疊含量有所增加，β-轉角和無規卷曲含量變化不顯著。研究表明α-螺旋結構含量的變化與靜電作用有關，而β-折疊結構的變化則與疏水作用相關[24]。α-螺旋結構是由蛋白質的羥基和氨基之間的氫鍵所維持的，在不同離子強度條件下氫鍵受到了一定的影響，同時高離子強度條件下蛋白質通過特殊的離子作用穩固偶極子而增強了疏水作用，導致蛋白質分子H0增強[25]。通過與H0變化規律相關性分析表明，大豆11S球蛋白H0與α-螺旋結構含量呈顯著負相關（r=－0.799，P＜0.05）。Kato等[26]對天然蛋白質與變性蛋白質的表面性質研究表明，蛋白質的H0與α-螺旋結構含量呈負相關，這與本實驗的研究結果一致。

2.3.2 不同離子強度條件下大豆11S球蛋白氨基酸側鏈分析

蛋白質拉曼光譜的850 cm－1和830 cm－1譜峰是酪氨酸殘基的對位取代苯的有關振動，由于環的呼吸振動和面外彎曲倍頻之間的費米共振，兩譜峰成對出現。兩峰的強度比（I850/I830）為費米共振線，可用來表征酪氨酸殘基的包埋與暴露情況[27]。當I850/I830比值為0.3～0.5時，酪氨酸殘基趨向于“包埋”態；當I850/I830比值為1.25～1.40時，酪氨酸殘基趨向于“暴露”態；當0.5＜I850/I830＜1.25時，酪氨酸殘基一部分暴露于蛋白質分子表面，一部分包埋在蛋白質內部。可根據I850/I830的值計算包埋在分子內部和暴露在分子表面的酪氨酸殘基的分子數N[28]。由表2可以看出，酪氨酸費米共振線I850/I830比值在0.5～1.25范圍內，隨著離子強度的增加，I850/I830比值變化不顯著。雖然N包埋略有增加，但是N暴露/N包埋顯著增加，這表明隨著離子強度的增加，大豆11S球蛋白的酪氨酸殘基趨向于“暴露”態。

表2 不同離子強度條件下酪氨酸與色氨酸殘基包埋/暴露情況Table 2 Embedding/exposure of tyrosine and tryptophan residues at different ionic strengths

756 cm－1附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側鏈，色氨酸拉曼光譜強度（I756）可以反映色氨酸微環境的極性，色氨酸譜帶的強度越小，表明越多的色氨酸殘基由蛋白質分子內部暴露于分子表面。由表2可以看出，隨著離子強度的增加，大豆11S球蛋白分子內的色氨酸殘基拉曼光譜強度逐漸降低，這表明鹽離子的添加使大豆11S球蛋白分子內的色氨酸殘基暴露于分子表面，色氨酸殘基從“包埋”態轉變為“暴露”態，這與酪氨酸費米共振I850/I830的分析結果一致。這種氨基酸側鏈的暴露可能是由于蛋白質空間結構展開引起的，從而導致H0的增加。

2.3.3 不同離子強度條件下大豆11S球蛋白二硫鍵分析

二硫鍵是大豆蛋白中的重要功能基團，對穩定蛋白質的空間結構起著關鍵作用。蛋白分子內二硫鍵的構型發生改變將對蛋白質的空間結構產生一定的影響，同時蛋白質的功能特性也隨之改變[29]。天然蛋白的二硫鍵伸縮振動一般在500～510 cm－1范圍內，即為g-g-g構型，如果在這個范圍內的譜帶強度減小或發生位移，在515～525 cm－1（g-g-t構型）和535～545 cm－1（t-g-t構型）出現拉曼特征峰，則意味著蛋白質分子中二硫鍵構型發生了改變[30]。為了研究離子強度對大豆11S球蛋白二硫鍵特征拉曼光譜峰強度和位置的影響，采用Peak Analyzer軟件進行多峰值Guassina擬合，得到不同離子強度條件下大豆11S球蛋白二硫鍵構型相對含量的變化，結果如圖4所示。不同離子強度條件下大豆11S球蛋白分子的二硫鍵構型發生了改變，隨著離子強度的增加，大豆11S球蛋白中g-g-g構型和g-g-t構型呈降低趨勢，而t-g-t構型逐漸增加，但在高離子強度條件下變化較小。結合不同離子強度條件下H0分析發現，隨著離子強度的增加，大豆蛋白H0與g-g-g和g-g-t構型的二硫鍵含量呈負相關，而與t-g-t構型的二硫鍵含量呈正相關，這表明二硫鍵的構型可能會影響蛋白質的H0。

圖4 不同離子強度條件下大豆11S球蛋白二硫鍵構型的變化Fig. 4 Conformational change of disulfide bond of 11S glycinin at different ionic strengths

3 結 論

隨著離子強度（0～0.9）的增加，大豆11S球蛋白的溶解性降低，H0增加，Zeta電位絕對值降低，平均粒徑增加。離子強度的升高引起靜電屏蔽作用的增加，使蛋白質分子間的靜電排斥力降低，從而促進蛋白質分子聚集。同時高離子強度條件下蛋白分子的球狀結構變得松散，分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露出來，導致大豆11S球蛋白的溶解性降低、H0增加。拉曼光譜分析表明隨著離子強度的增加，大豆11S球蛋白二級結構中α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加，蛋白質的酪氨酸和色氨酸殘基由“包埋”態轉變為“暴露”態，這種變化可能是由于蛋白質空間結構展開引起的，從而導致H0的增加。不同離子強度條件下大豆11S球蛋白的二硫鍵構型發生了改變，二硫鍵構型的改變可能會影響蛋白質的H0。

參考文獻：

[1] 魏冬旭, 江連洲, 王辰, 等. pH值對大豆11S球蛋白結構和表面疏水性的影響[J]. 食品科學, 2015, 36(11): 1-5. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201511001.

[2] MUJOO R, TRINH D T, PKW N. Characterization of storage proteins in different soybean varieties and their relationship to tofu yield and texture[J]. Food Chemistry, 2003, 82(2): 265-273. DOI:10.1016/S0308-8146(02)00547-2.

[3] HAQUE Z Z, ARYANA K J. Effect of copper, iron, zinc and magnesium ions on bovine serum albumin gelation[J]. Food Science Technology Research, 2002, 8(1): 1-3. DOI:10.3136/fstr.8.1.

[4] SCHOKKER E P, SINGH H, PINDER D N, et al. Heat-induced aggreation of β-lactoglobulin AB at pH 2.5 as influenced by ionic strength and protein concentration[J]. International Dairy Journal,2000, 10(4): 233-240. DOI:10.1016/S0958-6946(00)00047-9.

[5] CLARK A H, KAVANAGH G M, ROSS-MURPHY S B. Globular protein gelation-theory and experiment[J]. Food Hydrocolloids, 2001,15(4): 383-400. DOI:10.1016/S0268-005X(01)00042-X.

[6] 李向紅, 華欲飛, 劉展, 等. 不同離子強度大豆分離蛋白熱誘導聚集體的研究[J]. 中國食品學報, 2010, 10(2): 104-109. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2010.02.015.

[7] MILLS C, HUANG L, NOEL R, et al. Formation of thermally induced aggregates of the soya globulin β-conglycincin[J]. Biochemica et Biophysica Acta, 2001, 1547: 339-350. DOI:10.1016/S0167-4838(01)00199-6.

[8] NAGANO T, HIROTSUKA M, MORI H, et al. Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40(6): 941-944. DOI:10.1021/jf00018a004.

[9] SAMOTO M, MAEBUCHI M, MIYAZAKI C, et al. Abundant proteins associated with lecithin in soy protein isolate[J].Food Chemistry, 2007, 102(1): 317-322. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.05.054.

[10] ZHAO C B, ZHOU L Y, LIU J Y, et al. Effect of ultrasonic pretreatment on physicochemical characteristics and rheological properties of soy protein/sugar Maillard reaction products[J]. Journal of Food Science and Technology, 2016, 53(5): 2342-2351. DOI:10.1007/s13197-016-2206-z.

[11] ZHAO C B, ZHANG H, XU X Y, et al. Effect of acetylation and succinylation on physicochemical properties and structural characteristics of oat protein isolate[J]. Process Biochemistry, 2017,57: 117-123. DOI:10.1016/j.procbio.2017.03.022.

[12] 李楊, 李秋慧, 王海晴, 等. 大豆蛋白-磷脂酶解物共建乳化體系性質研究[J]. 中國食品學報, 2015, 15(11): 41-47. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.11.007.

[13] 張萍, 鄭大威, 劉晶, 等. 基于表面增強拉曼光譜技術的豆芽6-BA殘留快速檢測方法[J]. 光譜學與光譜分析, 2012, 32(5): 1266-1269.DOI:10.3964/j.issn.1000-0593(2012)05-1266-04.

[14] LI X, CHENG Y, YI C, et al. Effect of ionic strength on the heatinduced soy protein aggregation and the phase separation of soy protein aggregate/dextran mixtures[J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23:1015-1023. DOI:10.1016/j.foodhyd.2008.07.024.

[15] RENKEMA J M S, GRUPPEN H, VANVLIET T J. Influence of pH and ionic strength on heat-induced formation and rheological properties of soy protein gels in relation to denaturation and their protein compositions[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2002, 50(21): 6064-6071. DOI:10.1021/jf020061b.

[16] MORZEL M, GATELLIER P, SAYD T, et al. Chemical oxidation decreases proteolytic susceptibility of skeletal muscle myofibrillar proteins[J]. Meat Science, 2006, 73(3): 536-543. DOI:10.1016/j.meatsci.2006.02.005.

[17] SYRBE A, BAUER W J, KLOSTERMEYER H. Polymer science concepts in dairy systems: an overview of milk protein and food hydrocolloid interaction[J]. International Dairy Journal, 1998, 8:179-193. DOI:10.1016/S0958-6946(98)00041-7.

[18] 張輝. 離子強度對大豆分離蛋白結構及表面疏水性的影響[J]. 食品工業科技, 2016, 37(8): 145-149. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.021.

[19] YOSHIKO M, YOSHIE K, KUNIO T. Protective effect of small amounts of sodium dodecyl sulfate on the helical structure of bovine serum albumin in thermal denaturation[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2003, 257(1): 41-46. DOI:10.1016/S0021-9797(02)00017-6.

[20] GRUNE T, JUNG T, MERKER K, et al. Decreased proteolysis caused by protein aggregates, inclusion bodies, plaques, lipofuscin, ceroid,and ‘aggresomes’ during oxidative stress, aging, and disease[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2004, 36(12):2519-2530. DOI:10.1016/j.biocel.2004.04.020.

[21] ZHAO C B, WU F, LI Y P, et al. Effects of β-glucans on properties of soya bean protein isolate thermal gels[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2015, 50(2): 347-355. DOI:10.1111/ijfs.12635.

[22] 伍林, 歐陽兆輝, 曹淑超, 等. 拉曼光譜技術的應用及研究進展[J]. 光散射學報, 2005, 17(2): 180-186. DOI:10.3969/j.issn.1004-5929.2005.02.013.

[23] 柯惟中, 余多慰, 陳婉蓉, 等. 熱處理和紫外輻射DNA影響的拉曼光譜研究[J]. 光學學報, 1997, 17(12): 1681-1683.

[24] PRZYBYCIEN T M, BAILEY J E. Secondary structure perturbations in salt-induced protein precipitates[J]. Biochimica et Biophysica Acta,1991, 1076(1): 103-111. DOI:10.1016/0167-4838(91)90226-P.

[25] SREERAMA N, VENYAMINOV S Y U, WOODY R W. Estimation of the number of α-helical and β-strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy[J]. Protein Science, 1999, 8(2): 370-380. DOI:10.1110/ps.8.2.370.

[26] KATO A, NAKAI S. Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins[J]. Biochemica et Biophysica Acta, 1980, 624(1): 13-20.DOI:10.1016/0005-2795(80)90220-2.

[27] ELLEPOLAA S W, CHOIB S M, PHILLIPSC D L, et al. Raman spectroscopic study of rice globulin[J]. Journal of Cereal Science,2006, 43(1): 85-93. DOI:10.1016/j.jcs.2005.06.006.

[28] ICONOMIDOU V A, CHRYSSIKOS D G, GIONIS V, et al.Secondary structure of chorion proteins of the teleostean fish Dentex dentex by ATR FT-IR and FT-Raman spectroscopy[J].Journal of Structural Biology, 2000, 132(2): 112-122. DOI:10.1006/jsbi.2000.4307.

[29] CIMPOIU C, CASONI D, HOSU A. Separation and identification of eight hydrophilic vitamins using a new TLC method and Raman spectroscopy[J]. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 2005, 28(16): 2551-2559.DOI:10.1080/10826070500189737.

[30] TSUNURA K, ENATSU M, KURAMORI K, et al. Conformational change in a single molecular species, β3 of β-conglycinin in acidic ethanol solution[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2001,65(2): 292-297. DOI:10.1271/bbb.65.292.