反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿或肝組織中阿霉素含量

蔡迪鳴 張爽 劉艷杰

近年來, 隨著肝臟腫瘤的局部化療方法的快速發展, 很多肝動脈介入治療和門靜脈的化療等方式愈加普遍［1］, 阿霉素是一種較為常見的化療藥物, 臨床有效的應用在各類腫瘤的治療之中, 但是其濃度過高會產生生物毒性, 影響骨髓造血功能, 嚴重時導致心力衰竭、心肺功能損害等［2］。本文旨在發現一種能夠較為準確測定血漿和肝組織中阿霉素濃度的方式。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇成年大鼠30只, 雌雄不拘, 體重350 g左右。主要試劑有阿霉素(Doxorubicin, DOX)標準品, 100 mg, 中國藥品生物制品會監制；柔紅霉素(Daunorubicin, DAM)標準品,100 mg, 中國藥品生物制品會監制［3］。主要應用儀器為美國惠普公司生產的HP100型高效液相色譜儀, HPLC色譜柱,美國惠普公司熒光檢測器。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 首先, 使用HPLC不銹鋼色譜柱進行試驗, 其中有流動的配管, 超純水, 0.1 mol/L的磷酸, 三乙酸等,將水相和乙酸等繼續充分混合, 保證HCl的pH數值調節到2.8左右, 將流速設定為1.6 ml/min并使用熒光檢測激發光和吸收光的具體波長, 內標物質為：柔紅霉素, 標本進樣量：保證在 50 μl左右。

1.2.2 標準品準備 設置鹽酸阿霉素儲備液并精密稱取25 mg的鹽酸阿霉素, 將其與25 ml甲醇混合溶解之后配母液,在隱蔽處儲存于25 ml保存瓶之中, 制定柔紅霉素的貯備液,精密化取用25 ml柔紅霉素, 并將其與甲醇溶解后避光儲存在25 ml的保存瓶之中, 進行備用。

1.2.3 標本處理 對大鼠進行阿霉素注射, 并獲取大鼠下腔部位靜脈血共計3 ml, 獲取大鼠的肝臟組織共計0.5 g, 并在冰箱中儲存, 進行血漿標本的有效處理, 其中吸取500 μl的血漿, 將其放置在20 ml的離心管中進行離心操作, 并適當加入100 μl工作濃度的柔紅霉素制成內標物質的標準溶液, 加入100 μl的0.2 M氯化鈣溶液進行靜置處理［4］, 并使用pH為9.0的硼醋酸與其融合之后加入氯仿等提取液, 除去上層的水相, 加入200 μl的磷酸, 并使用旋渦混勻器進行混合處理, 離心5 min之后去上層水相。將0.5 g肝組織放入1 ml的生理鹽水中進行處理, 其中內標為100 μl的柔紅霉素, 搖勻5 min后使用超生勻漿處理2 min。加投入8 ml氯仿等提取液,離心處理5 min后, 獲得上層清液待測。

1.2.4 檢測標準 將阿霉素的溶液分別制成5、10、25、250、500、1000 μg/ml等濃度的溶液, 并將上述的溶液分別與肝部組織的柔紅霉素和空白血漿進行標本處理, 將阿霉素峰面積和柔紅霉素峰面積的比值與具體的濃度進行比較。

2 結果

按照上述檢測方法得到色譜分析圖, 將阿霉素峰面積和柔紅霉素峰面積的比值為縱坐標, 濃度為橫坐標繪制標準曲線, 血漿線性回歸方程為：ADOX/ADAM=0.0201X+0.1105, 血漿最小檢測濃度為6 ng/ml, 對于其濃度變化, 在6～1000 ng/ml中變化較好。肝臟組織線性回歸方程為：ADOX/ADAM=0.0198X-0.9855, 肝臟最小檢測濃度為26 ng/ml, 其應用范圍為26～2000 ng/ml之間, 線性關系表現較好。見圖1。

圖1 阿霉素與柔紅霉素峰面積關系圖

3 討論

阿霉素屬于蒽環類抗腫瘤藥物, 在乳腺癌、胃癌、肺癌等癌癥中應用較為頻繁, 在化療過程中, 阿霉素可以有效的抑制患者體內DNA和RNA的合成, 其中對于RNA的合成抑制作用更加顯著, 阿霉素作用效果相對較好, 屬于周期非特異性藥物［5-7］。其能夠快速殺滅周期中的各類腫瘤細胞,對于急性白血病, 如急性淋巴細胞白血病、粒細胞白血病等效果良好, 其同時可以與其他的抗癌藥物進行搭配使用, 但是該種藥物擁有較強的副作用［8,9］, 臨床對其濃度進行全面有效的檢測, 現階段, 反相高效液相色譜法已經建立, 并成為了藥物濃度檢測的重要方法, 得到了臨床的廣泛使用, 當前的研究中, 對于血漿和唾液中的阿霉素研究數量一般較多,但是對于組織內部阿霉素濃度的研究內容相對較少。

本次實驗中, 首先需要將阿霉素從肝組織中成功釋放出來, 可以使用組織的勻漿處理誘導肝細胞的破裂, 適當釋放阿霉素, 對于阿霉素來說, 氯仿等生物有機溶劑屬于相對較好的提取溶劑, 能夠將阿霉素從勻漿液中完成有效的提取到有機溶劑中, 使用氮氣的方式進行吹干操作后, 仍然需要進行有機物的溶解操作, 檢測到的藥物物質將會更加集中化,檢測值顯著降低, 對檢測的精度有著較好的提高作用, 但是以上的勻漿方式不能誘導肝細胞的破裂, 很多阿霉素無法從肝細胞中較好的釋放出來, 很多藥物不能直接通過萃取過程轉移到有機溶劑之中, 因此, 對于肝臟的檢測限度值一般高于血漿的檢測限度值。

在本次的研究中, 首先進行勻漿處理, 其次沉淀蛋白質,萃取, 有機復溶等, 最終有效的測定了血漿和肝部組織中的阿霉素濃度, 為阿霉素的濃度測定和后續的藥物質量研究有著較好的作用。

綜上所述, 反相高效液相色譜熒光檢測法能夠較好地測定血漿和肝臟組織內阿霉素的藥物濃度, 其操作的靈敏度相對較高, 且較為簡單, 穩定性強。

［1］ 符繼紅, 褚金芳 , 王吉德, 等.固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法測定擬南芥中的生長素.分析化學, 2009, 37(9):1324-1327.

［2］ 潘義勤, 潘秀萍, 潘繼剛.反相高效液相色譜-熒光檢測法測定粉針劑中帕米膦酸二鈉含量及有關物質.中國藥物應用與監測, 2008, 5(1):29-31.

［3］ 張宏文, 錢立新, 王蔚青, 等.反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿及膀胱中阿霉素的濃度.藥學與臨床研究, 2006, 14(1):4-6.

［4］ 姚藍, 徐和新 , 苗積康, 等 .反相高效液相色譜-熒光檢測法測定血漿中拉貝洛爾的含量.中國藥物應用與監測, 2005, 2(3):18-20.

［5］ 秦永平, 鄒遠高, 梁茂植, 等.柱切換-熒光檢測反相高效液相色譜法測定血漿中特布他林濃度.分析化學, 2004, 32(9):1216-1218.

［6］ 傅承光, 徐宏達.反相高效液相色譜法柱后調節PH膠束增敏熒光檢測四環素類藥物的研究.色譜, 1995(5):365-367.

［7］ 何素梅, 魏樹禮, 吳傳斌, 等.反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿或肝組織中阿霉素含量.藥物分析雜志, 1994(4):8-11.

［8］ 張志友, 張文怡, 李宏偉, 等.反相高效液相色譜法檢測組織中阿霉素含量的實驗研究.武警后勤學院學報(醫學版), 2000(1):37-40.

［9］ 呂興萍, 童姍姍.反相高效液相色譜熒光檢測法測定血漿中阿霉素的濃度.安徽科技學院學報, 2008, 22(5):31-35.