疏肝健脾活血方對大鼠肝星狀細(xì)胞TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響

周 凝 楊 欣 夏雪皎 張俊杰

肝纖維化是逆轉(zhuǎn)肝硬化發(fā)生發(fā)展的重要節(jié)點(diǎn)，研究[1]表明，肝纖維化最終的共同通路均是由肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）所調(diào)節(jié)的，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化因子β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）/Smads信號(hào)通路對HSC的活化增殖及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有重要影響。疏肝健脾活血方是浙江省名中醫(yī)周庚生教授治療肝纖維化的有效復(fù)方，本課題組前期研究表明疏肝健脾活血方對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化有保護(hù)肝細(xì)胞，減輕肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抗肝纖維化的作用[2-6]。本研究以TGF-β1誘導(dǎo)HSC-T6作為活化的肝星狀細(xì)胞的研究模型，從TGF-β1/Smads信號(hào)通路探討疏肝健脾活血方延緩肝纖維化的細(xì)胞分子機(jī)制，為中藥復(fù)方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 清潔級雄性SD大鼠（體質(zhì)量200±20g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（浙）2015-0001）；疏肝健脾活血方（桃仁 15g，桂枝 10g，制大黃 6g，甘草 8g，香附、白術(shù)、莪術(shù)各10g，鱉甲 15g，參三七 3g，茯苓 15g，丹參、紅棗各30g），中藥均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)濱江中醫(yī)門診部；大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6（上海第二軍醫(yī)大學(xué)張俊平教授惠贈(zèng)）；重組人TGF-β1（購自R&D Systems公司，批號(hào)AV6915072）；五組shRNA重組慢病毒質(zhì)粒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司委托合成）；PCR引物（上海生工生物公司合成，見表1）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1疏肝健脾活血方含藥血清制備 將疏肝健脾活血方中藥飲片煎煮、濾出藥液后水浴蒸發(fā)至2.7g/mL的濃度。取10只清潔級雄性SD大鼠按10mL/（kg·d）灌胃，連續(xù)3天，最后一次灌藥1h后麻醉、腹主動(dòng)脈采血，4℃、3000rpm（有效離心半徑15cm），20min，離心分離血清，56℃水浴中滅活 30min，0.22μm微孔濾膜過濾，得到的含藥血清配置成40%濃度備用。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選擇慢病毒載體及四組shRNA表達(dá)重組慢病毒質(zhì)粒加入綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），組裝、濃縮、基因測序鑒定及滴度測定后證實(shí)插入序列正確。48h后熒光倒置顯微鏡下觀察HSC-T6細(xì)胞GFP的表達(dá)變化，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time quantitative PCR，QRT-PCR）檢測Smad4 mRNA的表達(dá)，篩選沉默Smad4（Smad4 mRNA interference，Smad4 RNAi）的HSCs-T6細(xì)胞株（Smad4 RNAi HSCs-T6）進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將篩選出的Smad4 RNAi HSCs-T6細(xì)胞株和HSCs-T6細(xì)胞株接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，HSCs-T6細(xì)胞分組：空白對照組、TGF-β1模型組、TGF-β1+含藥血清組；Smad4 RNAi HSCs-T6細(xì)胞分組：Smad4 RNAi組、Smad4 RNAi+TGF-β1模型組，Smad4 RNAi+TGF-β1+含藥血清組；共六組。空白對照組用DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，TGF-β1模型組、Smad4 RNAi+TGF-β1模型組再加用工作濃度為5ng/mL的TGF-β1試劑處理，TGF-β1+含藥血清組及Smad4 RNAi+TGF-β1+含藥血清組，再加用40%的疏肝健脾活血方含藥血清處理，處理時(shí)間均為24h。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorb-nent assay，ELISA）檢測I型膠原蛋白的相對量 上述六組處理24h后分別離心取上清液，另設(shè)空白對照孔和待測樣品孔，待測樣品孔中加入上述六組上清稀釋液（按1:5稀釋）及酶標(biāo)試劑，空白對照孔加相同體積的蒸餾水，溫育、洗滌后加入顯色劑及終止液，按序測量各孔的吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度和吸光度值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，計(jì)算出待測樣品的濃度，再乘以稀釋的倍數(shù)5，即為待測樣品的實(shí)際濃度。

表1 Samd2、Samd3、Samd4、Samd7引物序列、退火溫度和擴(kuò)充片斷

1.2.5QRT-PCR 測定 Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA相對表達(dá)量 上述六組處理24h后，洗滌細(xì)胞提取總RNA并檢測濃度和質(zhì)量，而后立即對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：預(yù)變性：95℃，30s；40 個(gè)循環(huán)（95℃，10s，60℃，30s）；溶解曲線：從55℃開始，每30s升高0.5℃，直到95℃，循環(huán)1次。所有反應(yīng)信息資料由PCR儀收集，通過計(jì)算機(jī)軟件測量和計(jì)算Ct值，以空白對照組為對照，GAPDH為內(nèi)參基因，由公式2-ΔΔCT計(jì)算可得各基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示，采用方差分析、t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠肝星狀細(xì)胞膠原I含量比較 與空白對照組比較，TGF-β1干預(yù)后HSC-T6的膠原I含量升高（P＜0.05）；與 TGF-β1 模型組比較，沉默 Smad4基因的Smad4 RNAi組及各含藥血清組HSC-T6的膠原I含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.2各組大鼠肝星狀細(xì)胞Smad2、3、4、7mRNA表達(dá)比較 與空白對照組比較，TGF-β1干預(yù)下的HSCT6 的 Smad2、Smad3、Smad7 mRNA 相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；沉默Smads基因后及中藥含藥血清干預(yù)下的HSC-T6細(xì)胞Smad2、Smad3、Smad4及Smad7 mRNA相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。與TGF-β1干預(yù)下的模型組比較，沉默Smads基因后及中藥含藥血清干預(yù)下的HSC-T6細(xì)胞Smad2、Smad3、Smad4 及 Smad7 mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表 3。

表2 各組大鼠肝星狀細(xì)胞膠原I含量比較（pg/mL，x±s）

3 討論

肝纖維化是逆轉(zhuǎn)肝硬化發(fā)生發(fā)展的重要過渡期，目前研究表明，肝纖維化的最終共同通路均是由HSC所調(diào)節(jié)的[7-8]，Bansal[9]認(rèn)為HSC的纖維化發(fā)展與其細(xì)胞的異質(zhì)性及微環(huán)境有關(guān)，故通過阻斷介導(dǎo)HSC由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變成活化狀態(tài)的信號(hào)通路而改變細(xì)胞微環(huán)境，是肝纖維化治療的重要切入點(diǎn)。王宇涵等[10-11]在研究中指出TGF-β1是促進(jìn)HSC激活及增殖必需的生物調(diào)節(jié)因子，Smads又是TGF-β1的重要作用底物[12-13]，可見TGF-β1/Smads信號(hào)通路對HSC的活化增殖及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有重要影響。其中Smad蛋白家族成員分為三類，分別為受體型Smad（包括 Smadl、2、3、5、8），是 TGF-β 的 I型受體激酶的底物，通用型Smad（Smad4屬于此類）和抑制型 Smad（包括 Smad6、7）。在本實(shí)驗(yàn)中，與以 TGF-β1干預(yù)的模型組作為對照，在沉默Smads4基因后，Ⅰ型膠原合成減少（P＜0.05），Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），證實(shí)阻斷 TGF-β1/Smads信號(hào)通路可明顯抑制肝纖維化。

疏肝健脾活血方以《傷寒論》中桃核承氣湯為基礎(chǔ)，并結(jié)合多年抗肝纖維化的臨床實(shí)踐化裁而成。本研究發(fā)現(xiàn)在疏肝健脾活血方含藥血清干預(yù)下活化的HSC的Ⅰ型膠原合成顯著降低，同時(shí)Smad2、Smad3、Smad4及Smad7 mRNA相對表達(dá)量全面下調(diào)（P＜0.05），沉默Smads4基因后得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。說明疏肝健脾活血方在離體條件下可以延緩肝纖維化的進(jìn)程，其機(jī)制可能與阻斷TGF-β1/Smads信號(hào)通路有關(guān)，但其對抑制型Smad（Smads7）的抑制作用有待進(jìn)一步深入探討。

表3 各組大鼠肝星狀細(xì)胞Smad2、3、4、7 mRNA表達(dá)比較（x±s）

［1］勞遠(yuǎn)翔，賀福初，姜穎，等.肝星狀細(xì)胞的去活化機(jī)制與抗肝纖維化治療［J］.中華肝臟病雜志，2015，23（1）：77-80.

［2］張俊杰，林庚庭，滕飛，等.桃核參術(shù)湯對肝纖維化過程中腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（4）：930-933.

［3］張俊杰，黃亞鵬，李壽生，等.桃核參術(shù)湯對大鼠肝纖維化形成過程中 AngⅡ1型受體mRNA表達(dá)的影響［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5（7）：582-584+587

［4］趙治友，鄔亞軍，張俊杰，等.加味桃核承氣湯對肝纖維化大鼠TGF-β1蛋白表達(dá)的影響［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，34（2）：166-168.

［5］趙治友，林庚庭，張俊杰，等.加味桃核承氣湯對四氯化碳肝纖維化大鼠α-SMA表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（11）：1034-1036.

［6］趙治友，鄔亞軍，閻利，等.加味桃核承氣湯對四氯化碳肝纖維化大鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2008，15（5）：339-340.

［7］ Kong DS，Zheng SZ，et al.Research progress on mypfibroblasts：their sources and roles in liver fibrogensis［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（3）：297-300

［8］唐桂連.肝星狀細(xì)胞與肝纖維化［J］.國際消化病雜志，2012，32（5）：270-273.

［9］ Bansal MB.Hepatic stellate cells：fibrogenic，regenerative or both Heterogeneity and context are key［J］.Hepatol Int，2016，10（6）：902-908.

［10］王宇涵.鱉甲煎丸與羅格列酮對由TGF-β1刺激的大鼠肝星狀細(xì)胞活化和TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響［D］.河北醫(yī)科大學(xué)，2012.

［11］王宇涵，孫玉鳳，王卜，等.鱉甲煎丸及羅格列酮藥物血清對大鼠肝星狀細(xì)胞TβRⅡ和Smad3mRNA表達(dá)的影響［J］.河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，28（1）：3-4，23.

［12］周維晨，李俊，代坤坤，等.老鷹茶總黃酮中山奈酚-葡萄糖苷對TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（4）：499-502.

［13］周維晨.老鷹茶總黃酮中黃酮類單體對TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞增殖的影響及部分機(jī)制研究［D］.安徽醫(yī)科大學(xué)，2010.