艾灸干預大鼠類風濕關節炎的尿液代謝組學研究

朱 艷，俞紅五，潘喻珍，楊 佳，吳炳坤，胡 雪，曹云燕

(安徽中醫藥大學第二附屬醫院老年病科,安徽 合肥 230061)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的具有致殘性的全身自身免疫性疾病，主要侵犯關節滑膜，引起關節滑膜炎，隨著病程的進展會影響到心、肺、血管等重要臟器和組織，關節本身病變引起的關節畸形則導致患者生活不能自理，嚴重影響生活質量[1-3]。艾灸作為傳統的外治方法，能夠溫經通絡、活血祛瘀，既可以消除局部的寒凝、濕阻、瘀血，以改善局部血液循環，促進新陳代謝，又可以提高機體免疫功能和抗病能力，達到有效地治療本病的目的[4]。本課題組前期的研究證實，艾灸能夠改善RA患者的關節疼痛癥狀，能夠提高臨床療效，但對于艾灸治療RA的機制未進行深入研究[5]。

代謝組學作為新興學科，其整體性、動態性、即時性的特點與中醫有明顯的共性，因此代謝組學可以為艾灸治療RA的研究提供新方法。通過代謝組學方法尋找艾灸調節RA的標志性代謝產物及其代謝通路，明確相關物質的變化趨勢，能夠為中醫治療RA研究搭建現代化科技平臺。

基于此，本研究以代謝組學為檢測手段觀察艾灸對弗氏完全佐劑(Freund’s adjuvant complete, FCA)誘導的RA模型大鼠尿液中內源性代謝物的影響，初步探索艾灸干預RA的作用機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級Wistar雄性大鼠80只，體質量(150±10)g，由安徽省醫學科學研究所動物房提供。實驗室保持恒溫、恒濕，動物在明暗周期為12/12 h(明期6:00-18:00)條件下進行適應性飼養。

1.2 藥品 與試劑特制香煙型純艾條(直徑1 cm)：河南省南陽市臥龍漢醫艾絨廠；雷公藤多苷片(Tripterygiumwilfordiipolyglycosidetablet, TPT):每片10 mg，上海復旦復華藥業有限公司；FCA:美國Sigma公司。

1.3 儀器 7890A/5975C型氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometer, GC/MS)：美國安捷倫公司。

2 方法

2.1 模型復制方法 采用風、寒、濕環境因素+生物因子復合方法[6]復制RA模型。將大鼠放置在自制鋁合金、玻璃箱內，超聲霧化器控制箱內濕度，加冰塊，使箱內環境溫度控制在(6±2)℃，濕度80%～90%，電風扇風力定于高檔。所有需要復制模型的大鼠均被放入上述風、寒、濕環境中20 d，每日12 h(20:00-8:00)。第21天給大鼠足跖部注射FCA 0.5 mL致炎，以復制RA模型。觀察3 d，以24 h出現足踝部腫脹等急性炎性反應，48 h出現繼發性全身多發性關節炎，表現為前肢或對側肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結節出現，提示模型復制成功。

2.2 分組及治療 將模型復制成功的大鼠隨機分為模型對照組、TPT組和艾灸組，每組20只，另取20只未復制模型的大鼠作為正常對照組。

2.2.1 艾灸組 參照文獻[4]選取“足三里”“腎俞”穴，根據大鼠穴位圖譜作穴區定位，剪毛，標記顏色。致炎3 d后，艾灸組用特制香煙型純艾條距穴位2 cm處懸灸，每日治療1次，選1穴，兩穴交替使用，每次20 min，連續治療15 d。

2.2.2 TPT組 采用雷公藤溶液灌胃給藥，每日8 mg/kg，每日1次，共給藥15 d，每只大鼠給藥總量不超過24 mg[3]。

2.2.3 正常對照組和模型對照組 兩組大鼠均予以與TPT組等容積的生理鹽水。

2.3 尿液代謝組學檢測 在末次治療24 h后，各組各取7只大鼠置于代謝籠，留取24 h尿液，搖勻后收集尿液5 mL，加1% NaN 3溶液作為防腐劑，樣品收集后經3 000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃儲存，用于代謝組學檢測。取20 μL解凍尿液，加入等容積尿酶溶液(1 000 U)，37 ℃孵化60 min，分解尿素；加入240 μL冰冷乙醇，渦旋振蕩30 s，-20 ℃靜置60 min，在4 ℃和16 000×g條件下離心15 min；取200 μL上清液，干燥；向干燥物中加入30 μL濃度為20 mg/mL鹽酸羥胺吡啶，渦旋振蕩30 s，37 ℃處理90 min；繼續加入30 μL的BSTFA(含1% TMCS)，于70 ℃衍生60 min。

采用安捷倫7890A/5975C GC-MS聯用儀對尿液衍生物進行非靶向代謝組學檢測。色譜柱為安捷倫公司的HP-5ms熔融硅毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。載氣為高純氦氣(>99.999%)，流速恒定為1 mL/min，進樣量為1 μL(無分流模式)，溶劑延遲時間為6 min。柱溫程序：初始柱溫70 ℃，維持2 min，以6 ℃/min升溫至160 ℃，再以10 ℃/min升溫至240 ℃，最后以20 ℃/min升溫至300 ℃并維持6 min。進樣口、傳輸線和電子碰撞(EI)離子源溫度分別設定為250、290、230 ℃。EI能量為70 eV。以全掃描模式對質荷比(m/z)范圍50～600內的所有數據進行采集。

2.4 質譜數據預處理與統計分析 參照文獻[7]方法對GC-MS檢測得到的原始數據進行質譜數據預處理，包括峰識別、保留時間校正、峰對齊和反卷積分析，得到包含觀察量(樣本名)、變量(峰，即rt_mz)和豐度(峰面積)的峰表矩陣數據文件。對每個樣本中各峰的豐度進一步按照面積歸一化法進行處理。然后將該數據導入SIMCA軟件(版本13.0，Umetrics，Sweden)，按默認設置進行主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘-判別分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)，建立含最優主成分的統計模型。

2.5 差異性代謝物篩選與結構鑒定 PLS-DA分析是尋找差異性代謝物最常用的方法之一[8]。本項目根據PLS-DA的變量投影重要性(variable importance in the projection，VIP)大于1為閾值初步篩選差異代謝物。進一步采用SPSS 17.0進行單維統計分析(t檢驗)，篩選具有統計學意義(P<0.05)的代謝物。本項目結合PLS-DA模型的VIP值和t檢驗的P值進行聯合篩選，將同時滿足VIP>1和P<0.05的變量(代謝物)篩選為差異代謝物[9]，并進一步進行結構鑒定。差異性代謝物含量在兩組之間的倍數為歸一化的數據在兩組之間的比值(如組1/組2)的對數(以2為底)，正值表示組1大于組2，負值表示組1小于組2。差異性代謝物的結構鑒定程序：首先采用AMDIS軟件反卷積GC/MS原始數據，得到純化的質譜數據，然后與自建的標準品數據庫(包括保留時間)、Golm Metabolome Database和Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library自動進行比對，納入標準為匹配相似度大于80%。

3 結果

3.1 尿液樣本的GC/MS代謝組學檢測 采用目前較為成熟的GC/MS代謝組學平臺技術對尿液樣本進行檢測。各組代表性總離子流色譜圖(TIC)如圖1所示，可見當前樣本的GC/MS檢測具有峰容量大、信號強且保留時間重現性好等優點。對樣本制備過程中添加的內標(半乳糖醇)進行統計分析，發現內標豐度的變異系數(CV值)小于5%(4.96%)，說明當前的代謝組學檢測方法是可靠的。由于共流出峰的存在，數據相當復雜，故采用已發表的GC/MS代謝組學數據處理方法對采集到的質譜數據進行質譜數據預處理，將復雜的質譜信號轉化成有用的定性定量數據，以表征群體之間的代謝特征。在下面的分析中，將采用多維統計和單維統計相結合的方法來獲得組學特征。

3.2 PCA分析 為了處理復雜的代謝組學數據，筆者采用PCA對數據進行降維，建立模型。該模型得到6個有效主成分，解釋率R2X為0.817，預測率Q2為0.588。通常，它們的值大于 0.5，即表示模型質量較好[6]，因此該PCA模型是可靠的。圖2A為PCA得分圖，其中3個質控樣本(QC)聚集在PCA得分圖中間，表明當前的代謝組學方法穩定性好、可靠，適合于對各組樣本進行可視化表征。正常對照組分布于第一主成分(用t[1]表示)左側，而其他3組則分布于右側并從整體上交織在一起。PCA模型常用于真實地反映各組間的差異，但是由于代謝組較基因組、轉錄組和蛋白質組靈敏，受到遺傳背景和環境干擾的影響比基因組、轉錄組和蛋白質組大得多，對于哺乳動物來說，尤為明顯，通常導致組間的固有差異被干擾。

注：A.正常對照組；B.艾灸組；C.模型對照組；D.TPT組圖1 各組尿液樣本代表性總離子流色譜圖

為了消除這種影響，通常采用監督性模型如PLS-DA進行分析。PLS-DA是基于偏最小二乘法線性回歸、有監督的模式識別的統計分析方法，通常適用于樣本量少、變量多、變量之間有相關性以及存在噪音變量干擾等情況[8]。去掉QC后，建立含6個有效主成分的PLS-DA模型，得分圖見圖2B和2C。模型累積解釋率R2X為0.793，R2Y為0.974，累積預測率Q2為0.908。置換檢驗(permutation test)分析(圖2D)表明當前模型不存在過擬合現象。而CV-ANOVA分析的P值為0.002 8，也說明PLS-DA模型不存在過擬合現象。綜上分析，說明當前建立的PLS-DA模型是可靠的。圖2B顯示正常對照組與其他3組在第一主成分上具有顯著差異，而治療后與治療前在第二主成分上具有較顯著的差異，表明TPT和艾灸均對RA模型大鼠代謝產生明顯的干預效果。圖2C顯示TPT組和艾灸組在第3主成分上具有顯著差異，說明二者的治療作用又是不同的。因此，尿液代謝組學多維統計分析表明，TPT和艾灸對RA大鼠的代謝均具有一定干預效果，且二者的作用存在差異。

3.3 潛在生物標志物的鑒定 為了篩選出導致各組之間顯著不同的代謝譜的代謝物，兩個重要參數即PLS-DA模型的VIP和t檢驗的P值被用于篩選潛在的生物標志物。那些VIP>1(表示這些變量對聚類具有高于平均水平的影響)的差異變量和P<0.05被篩選為差異性代謝物，這些代謝物貢獻于組間顯著的代謝差異。對比正常對照組和模型對照組，最終從尿液中篩選并鑒定到9個差異性代謝物，主要涉及氨基酸、嘧啶、脂肪酸和腸道菌群等代謝通路。各組大鼠主要差異性尿液代謝物相關系數比較見表1。由表1可見，正常對照組較模型對照組的變化主要體現于色氨酸、對羥基肉桂酸、羥基苯丙酸、氨基丁酸、甲基胞嘧啶、喹啉酸、脫氧核糖水平低下，油酸、膽固醇水平升高；艾灸組較模型對照組的變化主要體現于氨基丁酸、甲基胞嘧啶、喹啉酸、脫氧核糖水平升高；TPT組較模型對照組的變化主要體現于膽固醇水平低下，油酸、對羥基肉桂酸、羥基苯丙酸水平升高；TPT組較艾灸組的變化主要體現于膽固醇、甲基胞嘧啶、喹啉酸、氨基丁酸、脫氧核糖水平升高。

4 討論

艾灸療法作為中醫針灸學重要組成部分，其繼承和創新，需要應用現代科學技術與方法對其作用機制進行全方位的研究，以闡釋艾灸作用機制的科學內涵。代謝組學這種具有生命科學整體水平和總聯系的研究方法的出現，與艾灸的整體性調節效應相契合，符合中醫整體觀和動態平衡觀。因此，基于代謝組學研究艾灸治療RA的效應與作用機制，更符合研究的實際需要，將有利于從生物系統的整體水平深入、系統地闡釋艾灸治療RA的作用機制，推動艾灸療法的臨床運用。

圖2 PCA和PLS-DA得分圖及PLS-DA模型置換檢驗分析

代謝物模型對照組/正常對照組艾灸組/正常對照組TPT組/正常對照組TPT組/艾灸組代謝途徑油酸-0．94-2．59-脂肪酸代謝膽固醇1．21--0．210．57脂肪酸代謝色氨酸-1．98--0．67色氨酸代謝對羥基肉桂酸-1．96-1．77-酪氨酸代謝4?羥基苯丙酸-1．91-1．77-酪氨酸代謝2?氨基丁酸-2．481．22-0．92氨基酸代謝5?甲基胞嘧啶-1．021．11-0．67嘧啶代謝喹啉酸-0．490．46-0．53色氨酸代謝脫氧核糖-1．282．10-1．65氨基酸代謝

注：差異性代謝物相關系數為兩組均值之比的對數值(以2為底)，“+”表示含量上升，“-”表示含量下降

本研究從尿液代謝組學角度研究艾灸對RA模型大鼠的作用機制。依據PCA結論，研究發現變化過程的重要因子依次為油酸、膽固醇、色氨酸、對羥基肉桂酸、4-羥基苯丙酸、胞嘧啶、氨基丁酸、喹啉酸、脫氧核糖形成過程中各階段代謝標志物。內源性代謝信息的擾動主要影響的代謝通路涉及氨基酸代謝、嘧啶代謝、脂質代謝。

脂肪、蛋白質和糖類為體內三大營養物質，因此脂質代謝和氨基酸代謝與能量代謝密切相關。本研究發現氨基丁酸、色氨酸、羥基肉桂酸、脫氧核糖歸屬于氨基酸代謝的產物，而膽固醇、油酸歸屬于脂質代謝的產物，胞嘧啶和脫氧核糖則為嘧啶代謝。

RA患者的血脂代謝和炎性反應程度與其發生心血管疾病危險性有關，通過藥物干預RA患者的炎癥的同時脂質代謝亦發生相應的改變[10]。而研究發現油酸可降低血液總膽固醇和有害膽固醇，卻不降低有益膽固醇。亞油酸具有能降低總膽固醇、三酰甘油，預防動脈粥樣硬化，促進細胞代謝，改善細胞再生的作用[11]。本實驗結果發現，RA模型大鼠尿液中參與脂肪代謝的膽固醇水平均增高而油酸水平下降，經艾灸干預后的RA模型大鼠尿液中膽固醇代謝物水平均下調，提示艾灸可逆轉脂肪代謝異常，起到調脂的作用。

羥基肉桂酸即對香豆酸，廣泛存在于自然界植物當中，為白花蛇舌草、海金沙草、杜仲葉的有效成分之一，具有預防心血管疾病、抗菌消炎等對人體有益的生物活性[12]。另外，對香豆酸是氨基酸代謝途徑的中間產物，是合成類黃酮、異黃酮等高價值保健營養品的中間體。氨基丁酸是中樞神經系統中很重要的抑制性神經遞質，是一種天然存在的非蛋白組成氨基酸，具有良好的降血壓功效，又能促進人體內氨基酸代謝的平衡，調節免疫功能[13]。現代研究發現，在RA機體內發生了L-色氨酸、嘌呤核苷酸等代謝物譜的變化，提示RA的發生與能量代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、葡萄糖代謝、核酸代謝等密切相關，表明色氨酸代謝障礙與機體免疫耐受有關[14]。本實驗結果亦發現，RA模型大鼠尿液中色氨酸、對羥基肉桂酸、對羥基苯丙酸、氨基丁酸、甲基胞嘧啶、脫氧核糖水平明顯下降，經艾灸干預后色氨酸、氨基丁酸、甲基胞嘧啶、脫氧核糖水平明顯上升，說明艾灸亦參與了氨基酸代謝。

綜上所述，艾灸及TPT均可使RA異常的氨基酸、嘧啶及脂質代謝發生逆轉，提示艾灸及TPT均可調控RA體內氨基酸、嘧啶及脂質代謝通路，而艾灸在調控氨基酸代謝方面明顯優于TPT組。艾灸調控氨基酸代謝可能是其治療RA的特異性體現。

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