當歸芍藥散含藥血清抑制內皮素-1介導的肝星狀細胞收縮的機制研究

劉浩坤，潘永福，周 敏，王運來，尹丹丹，許 釩

(安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012)

肝硬化腹水是諸多肝臟疾病的常見并發癥，是由肝功能減退、門靜脈高壓導致肝脾腫大，機體無法吸收蛋白質和維生素而在體液中形成高滲環境，導致腹腔積水增多引起的惡性疾病。該病主要臨床表現為腹脹、腹壁靜脈曲張、食管胃底靜脈曲張等，其中肝門靜脈高壓在肝硬化腹水的形成中起主導作用[1]。肝門靜脈高壓的形成系肝內血流阻力以及門靜脈血流量增加所導致的。研究表明，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)參與肝纖維化細胞外基質和肝臟微循環調節，其中RhoA/ROCK信號通路能夠活化HSCs[2-5]，而活化后的HSCs在肝門靜脈高壓形成過程中起重要作用[6-7]。研究發現，RhoA/ROCK通路激活后，可使肝內血管阻力增大，抑制內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的活性，刺激HSCs收縮，加速肝硬化靜脈高壓的形成[8-9]。

當歸芍藥散(Danggui Shaoyao San，DSS)出自張仲景《金匱要略》，由當歸、芍藥、川芎、白術、茯苓、澤瀉6味藥組成，具有活血利水之功效。研究表明，DSS可通過保護肝細胞、抗肝損傷作用而改善門靜脈循環障礙、增強免疫功能和促進利尿等[10-12]。本研究擬考察DSS含藥血清對內皮素-1(endothelin，ET-1)介導的HSCs中RhoA/ROCK Ⅱ和eNOS蛋白表達的影響，探討其機制，為該藥治療肝硬化腹水提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥材 DSS組方藥材購于安徽協和成藥業飲片有限公司，并經安徽中醫藥大學藥學院金傳山教授鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》(2015年版)項下標準。參照原方比例(當歸3 g，芍藥16 g，川芎8 g，白術、茯苓各4 g，澤瀉8 g)稱取藥材，醇提濃縮制備所含生藥濃度為1.72 g/mL的DSS提取液。

1.2 細胞株及動物 大鼠HSC-T6細胞株購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。該細胞株系SV40轉染SD大鼠HSCs而成，表型為活化的HSCs。健康雄性SD大鼠，200～220 g，購自安徽省實驗動物中心，生產許可證號為SCXK(皖)2011-002。

1.3 主要試劑 高糖培養基：Hyclone公司；胰酶消化液：碧云天生物技術研究所；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)：北京中杉生物技術有限公司；Y27632(ROCK抑制劑)：上海前塵生物科技有限公司；脫脂奶粉：上海光明乳品有限公司；電化學發光試劑盒：Thermo公司；BCA(bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術研究所；十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine,TEMED)：Sigma；NaCl：上海蘇懿化學試劑有限公司；甘氨酸：Solarbio；PVDF膜：Millipore公司；預染蛋白Marker：Thermo；過硫酸胺、丙烯酰胺：sigma；RhoA(兔多抗)、ROCK Ⅱ(兔多抗)：Abcam公司；eNOS(兔多抗)：Santa cruz。

1.4 主要儀器 滅菌鍋：日本Tomy KOQYO公司；多功能酶標儀：美國MD公司；超凈工作臺(YJ-1450)：蘇凈集團安泰公司；干燥箱：上海一恒科技有限公司；細胞培養箱：日本Sanyo公司；AF-10型自動制冰機：意大利SCOTSMAN；VE-186型轉膜儀、VE-180電泳槽、EPS300型電泳儀：Tanon；X膠片：Kodak；TS-1000水平搖床：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；純水機：美國SIM。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 取20只健康雄性SD大鼠，適應性飼養1周后隨機分為兩組：空白組和給藥組。給藥組以10 mL/kg給藥劑量每日灌胃DSS提取液2次(早晚各1次)，連續3 d；空白組給予等劑量的生理鹽水。末次給藥1 h后，腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉，于無菌狀態下腹主動脈采血，37 ℃靜置1 h后，3 500 r/min離心10 min，將相同條件下所采血清混和，56 ℃、30 min滅活，以除去可能存在的生物活性物質，再用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，密封后置于-20 ℃冰箱保存備用。同時以生理鹽水制備的正常大鼠血清作對照。將冷凍保存于液氮中的HSCs復蘇后接種于DMEM培養基(含10%胎牛血清、鏈霉素100 U/mL和青霉素100 U/mL)，37 ℃、50 mL/L CO2條件下培養。當細胞呈單層致密狀時，2.5 g/mL胰蛋白酶消化后傳代。

2.2 實驗分組 實驗均在呈指數生長的細胞中進行。空白組：無血清DMEM培養基+空白大鼠血清(終濃度為10%)；模型組：無血清DMEM培養基+空白大鼠血清(終濃度為10%)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)；DSS含藥血清低劑量組：無血清DMEM培養基+DSS含藥血清(終濃度為5%)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)；DSS含藥血清中劑量組：無血清DMEM培養基+DSS含藥血清(終濃度為10%)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)；DSS含藥血清高劑量組：無血清DMEM培養基+DSS含藥血清(終濃度為15%)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)；Y-27632抑制劑組：無血清DMEM培養基+Y-27632(終濃度為100 μmol/L)+ET-1(終濃度為10 nmol/L)。

2.3 Western blot法檢測 將上述分組的細胞處理后每瓶加含有苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(100 mmol/L)的裂解液約400 μL，冰浴下充分裂解細胞，細胞裂解液于4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，將離心后的上清液分裝轉入1.5 mL的離心管中于-20 ℃保存。用考馬斯亮藍G250染色測定蛋白濃度后，以每孔含25 μg蛋白的溶液為上樣量，SDS-PAGE凝膠(12%分離膠、5%濃縮膠)電泳(120 V/60 V)，轉膜至硝酸纖維素膜(NC膜)，5%脫脂奶粉于室溫下脫色搖床上搖動封閉4 h，封閉后加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，PBST(PBS+吐溫-20)洗膜3遍，加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液(1∶50 000)室溫孵育2～3 h后，洗膜，化學發光法顯影。將照片進行掃描或拍照，將目的條帶的分子量和凈光密度值用Bio-Rad凝膠圖像處理系統分析。

3 結果

3.1 DSS含藥血清對ET-1誘導的HSC-T6細胞內RhoA、ROCKⅡ蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組細胞內RhoA、ROCKⅡ蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，DSS含藥血清高、中、低劑量組及Y-27632抑制劑組均可顯著下調RhoA蛋白表達(P<0.05)，DSS含藥血清高、中、低劑量組可不同程度下調ROCK Ⅱ蛋白表達，其中高、中劑量組顯著下調ROCKⅡ蛋白的表達(P<0.05)；Y-27632抑制劑組可顯著抑制下調RhoA、ROCK Ⅱ蛋白的表達(P<0.05)。見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；A.空白組；B.模型組；C.DSS含藥血清低劑量組；D.DSS含藥血清中劑量組；E.DSS含藥血清高劑量組；F.Y-27632抑制劑組

3.2 DSS含藥血清對ET-1誘導的HSC-T6細胞內eNOS蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組細胞內eNOS蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，DSS含藥血清高、中、低劑量組均可上調eNOS蛋白表達水平，且呈現一定劑量依賴性，其中高、中劑量組上調eNOS表達作用顯著(P<0.05)。見圖2。

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；A.空白組；B.模型組；C.DSS含藥血清低劑量組；D. DSS含藥血清中劑量組；E.DSS含藥血清高劑量組

4 討論

HSCs具有收縮或舒張功能，在肝臟的微循環以及門靜脈高壓的調節過程有著非常重要的作用。ET是目前已知的縮血管活性最強的多肽物質，參與門靜脈高壓的形成[13]，而ET-1可促進HSCs活化、增殖和收縮，是肝硬化進程中的重要參與者，故本實驗采用ET-1為DSS含藥血清的調控對象。課題組前期研究發現，不同劑量的DSS含藥血清能夠有效抑制HSCs細胞肌動蛋白絲數量增多，同時可以不同程度地抑制ET-1引起的HSCs細胞膠原凝膠收縮[14]。故本實驗在此基礎上考察DSS含藥血清對ET-1誘導的HSCs細胞收縮的機制。

ET-1刺激引起的HSCs收縮不依賴鈣通道，其主要由Rho相關激酶信號途徑介導，在此途徑中RhoA/ROCK通路對HSCs收縮的調控機制是近年研究的熱點。Rho蛋白是許多膜表面受體的下游效應蛋白，在細胞的信號轉導通路中作為信號轉換器或分子開關，作用于細胞骨架或其靶蛋白而產生多種生物效應，在細胞形態學、細胞骨架功能、分泌和細胞收縮中均發揮作用[15]，RhoA是其中的一種，它參與調節肌動蛋白應力纖維的裝配，RhoA相關激酶ROCKⅠ、ROCK Ⅱ是其下游效應分子，接受RhoA傳遞的活化信號[16-17]。如果阻斷RhoA/ROCK信號通路，HSCs的活化、分泌、收縮等均會受到影響。ROCK抑制劑Y-27632是一類人工合成的吡啶類復合物，通常其以載體介導的方式被細胞攝取，在細胞內結合到Rho蛋白下游效應器Rho激酶的催化位點，從而抑制激酶活性[18]。本實驗中，模型組細胞內RhoA、ROCK Ⅱ蛋白表達水平較空白組均顯著升高，DSS含藥血清各劑量組較模型組均可不同程度下調RhoA、ROCKⅡ蛋白表達。實驗結果顯示，DSS含藥血清可通過抑制RhoA/ROCK通路來抑制HSC-T6細胞收縮。

eNOS廣泛存在于人體內皮細胞、心肌細胞、肥大細胞及血細胞中，通過經典eNOS/NO/PKG途徑促進平滑肌舒張來維持血管壁穩態[19]。其中NO作為一種強有力的血管內皮細胞舒張因子，具有強烈的擴張血管作用，并廣泛參與機體生理功能的調節。肝臟是NO主要合成場所，HSCs表達eNOS[20]。而eNOS可促進NO的合成，從而抑制細胞收縮產生舒張血管效應。有研究發現，激活的RhoA和ROCKⅡ可通過降低eNOS mRNA穩定性、抑制eNOS基因轉錄而降低eNOS水平[21]。在本實驗中，模型組細胞內eNOS蛋白表達水平較空白組均顯著降低，DSS含藥血清各劑量組與模型組相比均可上調eNOS蛋白表達。本實驗結果與文獻結果相一致，提示在細胞層面，eNOS的表達可調控HSC-T6細胞的收縮，DSS可能通過增加eNOS的表達，升高NO的含量達到抑制細胞收縮的作用。

本實驗研究發現，DSS含藥血清各劑量組對HSCs具有不同程度的影響，DSS作為一種可能的降低門靜脈高壓延緩肝纖維化的藥物，其對于細胞內介導HSCs收縮的鈣離子通道是否存在調節，對α-平滑肌肌動蛋白是否存在影響，及其對其他細胞因子的作用，還有待進一步的研究。

綜上所述，DSS含藥血清可能通過下調RhoA、ROCKⅡ蛋白的表達，上調eNOS蛋白的表達，從而降低肝內血管阻力以及門靜脈壓力，起到對ET-1介導的HSCs收縮的保護作用。

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