不同加工方式亳白芍的高效液相指紋圖譜及多成分含量比較

梁德勤，趙園園，羅 云，金傳山，吳德玲，張 偉，王 林，凌 偉

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012； 2.安徽協和成藥業飲片有限公司，安徽 亳州 236800)

白芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPalL.)的根，主產于安徽、四川、浙江及山東菏澤，其中以安徽省亳州市產量最大，市場占有率最高。產于亳州的白芍又習稱“亳白芍”。據了解，現亳白芍的種植面積達133 km2，并有進一步擴大的趨勢。目前，亳白芍飲片的加工與炮制主要遵循2015年版《中華人民共和國藥典》以及2005年版《安徽省中藥飲片炮制規范》有關要求進行，即將鮮白芍置沸水中煮后除去外皮，曬干為白芍藥材；再將白芍藥材通過軟化、切片和干燥等環節形成白芍飲片[1-2]。由于白芍藥材較難干燥，如遇陰雨天氣，未完全干燥的藥材易發黏，藥農不得已使用硫熏的方法來防止白芍發黏變色，從而導致白芍中芍藥苷含量下降，二氧化硫殘留量超標，影響白芍質量[3]。此外，將白芍藥材切制為飲片需要長時間浸泡、潤制等軟化環節導致有效成分流失嚴重[4]。近年來，有企業采用產地加工與炮制一體化的加工方式，在產地將白芍鮮藥直接加工為白芍片，縮短了加工時間，且減少了有效成分芍藥苷的流失。對于亳白芍產地加工與炮制一體化加工技術參數已有較多報道，而采用產地加工與炮制一體化的加工方式形成趁鮮片與傳統片標準煎液指紋圖譜和多指標成分的分析未見報道。

本研究主要以亳白芍不同加工方式飲片標準煎液為研究對象，以高效液相色譜法建立不同加工方式亳白芍飲片標準煎液的指紋圖譜，并以指紋圖譜共有峰相對峰面積對所有樣品進行聚類分析；同時對亳白芍不同加工品標準煎液中沒食子酸等7種成分含量進行測定，以更加全面地評價亳白芍傳統切制、煮后趁鮮切制以及鮮品直接切制3種不同加工方式對其飲片質量的影響，為亳白芍產地加工與炮制一體化應用的可行性提供科學依據。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司；島津ATY224-電子天平：日本Shimadzu；賽多利斯Sartorius百萬分之一電子天平：德國Sartorius公司；津騰GM-0.5A隔膜真空泵：天津市津騰實驗設備有限公司；科恒DL-1電子萬用電爐：上海科恒實業發展有限公司。

沒食子酸對照品(批號YAO505YA14，純度≥98%)、氧化芍藥苷對照品(批號Y31D5J1，純度≥98%)、芍藥內酯苷對照品(批號Z16M6B1，純度≥91.4%)、芍藥苷對照品(批號X27F8C30162，純度≥98%)、苯甲酸對照品(批號TS0911CA14，純度≥98%)、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖對照品(批號P29F7F10218，純度≥99%)、苯甲酰芍藥苷對照品(批號P02D7F26004，純度≥98%)：均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

白芍采自安徽省亳州市周邊鄉鎮，采集信息見表1，所有采集的白芍新鮮根部均經安徽中醫藥大學藥學院金傳山教授鑒定為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPalL.)的根。

表1 亳白芍樣品采集信息表

注：①BS1-BS9采自安徽省亳州市譙城區；②BS10雖采自毗鄰亳州市的河南省，但為亳白芍種質

10批白芍鮮品均在安徽協和成藥業飲片有限公司按照前期研究確定的工藝分別進行飲片加工。

白芍傳統片A1—A10：鮮白芍煮后，滾筒去皮機去皮，低溫烘干，即得白芍藥材；再將白芍藥材浸泡、潤制等軟化至適宜程度，置切藥機上切2～3 mm圓片，低溫烘干，得樣品A1-A10。

白芍趁鮮片B1-B10：鮮白芍煮后，滾筒去皮機去皮，低溫烘干至適宜程度，置切藥機上切2～3 mm圓片，低溫烘干，得樣品B1-B10。

白芍生斜片C1-C10：鮮白芍滾筒去皮機去皮，置切藥機上切2～3 mm斜片，低溫烘干。得樣品C1-C10。白芍生斜片近年大量出口至韓國及中國臺灣，在中國大陸鮮少應用，因此本研究擬對其質量進行研究。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酸、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷適量于25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，即得混合對照品溶液，用于指認指紋圖譜共有峰。

2.1.2 標準煎液供試品溶液的制備 精密稱取白芍飲片20 g于圓底燒瓶中，加入7倍量水，浸泡30 min，煎煮60 min，過濾，收集濾液，濾渣再用6倍量水煎煮40 min，合并兩次濾液，濃縮后轉移，并以水定容至100 mL容量瓶作為儲備液備用。精密移取儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻后靜置20 min，分出上清液，以0.45 μm有機濾頭濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件 美國Waters Symmetry ShieldTMRP18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)。二元梯度洗脫程序：0～20 min，5%→20% B；20～30 min，20%→25% B；30～45 min，25%→30% B；45～55 min，30%→35% B。柱溫為25 ℃，容積流量為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。檢測波長：0～8 min，274 nm；8～14 min，214 nm；14～18 min，257 nm；18～20.5 min，232 nm；20.5～28 min，220 nm；28～34 min，228 nm；34～38 min，217 nm；38～55 min，229 nm。各成分最大吸收波長分別以全波長掃描確定，芍藥苷在最大吸收波長處色譜峰過高，影響其余小峰的觀察，因此未采用最大吸收波長。檢測時間為55 min。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的建立 依照各點均勻分布在標準曲線上的原則，計算好最低濃度與最高濃度后，等間距配制或稀釋中間3個濃度，將各對照品配制后，分別進樣10 μL，按照“2.2”項下色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，對照品濃度(mg/mL)為橫坐標進行線性回歸，建立各成分的標準曲線，線性方程、相關系數及線性范圍見表2。

2.3.2 精密度試驗 取樣品A6，按“2.1.2”項下供試液制備方法制備供試液，連續進樣6次，以芍藥苷為參照峰，測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于0.07%，各色譜峰相對峰面積RSD均小于0.3%，證明白芍指紋圖譜及多成分分析方法精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取樣品A6，按“2.1.2”項下供試液制備方法平行制備6組供試液，分別進樣，以芍藥苷為參照峰，測得各色譜峰相對保留時間RSD均小于0.3%，各色譜峰相對峰面積RSD均小于1.0%，證明白芍指紋圖譜及多成分測定方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取樣品A6，按“2.1.2”項下供試液制備方法制備供試液，在室溫放置0、2、4、8、12、24、48 h后分別進樣，以芍藥苷為參照峰，測得27個共有峰的相對保留時間RSD均小于0.1%，各色譜峰相對峰面積RSD均小于0.1%，表明供試液在48 h內穩定性較好。

表2 7種成分線性方程、相關系數及線性范圍

2.3.5 加樣回收率試驗 取同一已知含量白芍樣品6份，每份5 g，精密稱定，分別精密加入7種對照品適量，按“2.1.2”項下供試液制備方法制備供試液(等比例縮小一倍)，并進樣測定，結果7個化合物的平均加樣回收率分別為99.00%、101.80%、100.77%、98.86%、99.58%、98.76%、98.47%，RSD均小于3%，表明建立的標準煎液定量方法準確性良好。

2.4 不同加工方法亳白芍標準煎液指紋圖譜 將10批亳白芍傳統片(A1—A10)高效液相色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012.130723版)》(2010國家藥典委員會)，以A1為參照圖譜，時間窗設為1.0，多點校正，自動匹配后以中位數法生成對照圖譜，標記為A0，匹配圖譜見圖1，10批傳統片相對于A0的相似度見表3。后將10批亳白芍趁鮮片(B1—B10)及A0導入相似度評價系統，并以A0為參照圖譜，多點校正，自動匹配，匹配圖譜見圖2，并記錄B1—B10共10批樣品標準煎液相對于A0的相似度，見表3。白芍生斜片(C1—C10)圖譜處理同亳白芍趁鮮片，匹配圖譜見圖3，10批樣品相對于A0的相似度見表3。

3種亳白芍飲片各自10批樣品的對照圖譜(B1—B10的對照圖譜為B0，C1—C10的對照圖譜為C0)及混合對照液高效液相色譜圖見圖4，30批白芍樣品共有峰為23個，其中由對照品指認7個，分別為3號峰(沒食子酸)、7號峰(氧化芍藥苷)、10號峰(芍藥內酯苷)、11號峰(芍藥苷)、20號峰(苯甲酸)、21號峰(1,2,3,4,6-O-沒食子酰葡萄糖)和22號峰(苯甲酰芍藥苷)。亳白芍傳統片與亳白芍趁鮮片的高效液相色譜圖共有峰數量及大小相當，而生斜片在芍藥內酯苷(7號峰)與芍藥苷(10號峰)之間出現了一個小峰，其余峰的數量與傳統片相當，部分峰的大小與亳白芍傳統片有差異。

對3種亳白芍飲片的指紋圖譜相似度進行單因素方差分析，結果顯示，亳白芍傳統片和亳白芍趁鮮片指紋圖譜相似度均明顯高于亳白芍生斜片(P<0.05)，而亳白芍傳統片和亳白芍趁鮮片指紋圖譜相似度比較，差異無統計學意義(P>0.05)。因此，亳白芍趁鮮片與亳白芍傳統片內在質量相似度較高，而生斜片略低。

注：從下至上依次是A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A0的圖譜

圖1亳白芍傳統片(A1—A10)標準煎液高效液相色譜匹配圖及其對照品(A0)圖譜

注：從下至上依次是B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、A0的圖譜

圖2亳白芍趁鮮片(B1—B10)標準煎液高效液相色譜匹配圖及其對照品(A0)圖譜

注：從下至上依次是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、A0的圖譜

圖3亳白芍生斜片(C1—C10)標準煎液高效液相色譜匹配圖及其對照品(A0)圖譜

注：3.沒食子酸；7.氧化芍藥苷；10.芍藥內酯苷；11.芍藥苷；20.苯甲酸；21. 1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖；22.苯甲酰芍藥苷

圖4 3種加工方式亳白芍飲片高效液相指紋圖譜

注：與亳白芍生斜片比較，*P<0.05

對30批亳白芍樣品的共有峰相對峰面積以組間聯接平方歐氏距離法進行聚類，聚類分析結果見圖5。結果顯示，亳白芍趁鮮片與傳統片聚為一類，亳白芍生斜片聚為一類，與相似度對比結果一致。

圖5 不同加工方式亳白芍飲片標準煎液聚類分析樹狀圖

2.5 亳白芍標準煎液中7種成分含量測定 取3種不同加工方式亳白芍飲片20 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備標準煎液供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣10 μL進行測定，以標準曲線法計算樣品中7種指標性成分含量，結果見表4。單因素方差分析結果表明，3種亳白芍飲片中氧化芍藥苷和芍藥內酯苷含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；亳白芍趁鮮片中芍藥苷與沒食子酸含量均明顯高于傳統片和生斜片(P<0.05)；3種亳白芍飲片中苯甲酸含量比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，亳白芍生斜片中苯甲酸含量最高，亳白芍傳統片中苯甲酸含量最低；亳白芍生斜片中1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖及苯甲酰芍藥苷含量均明顯低于傳統片及趁鮮片(P<0.05)。結果提示，亳白芍趁鮮片中7種成分與亳白芍傳統片中7種成分含量差異較小，而白芍生斜片中各成分含量與傳統片差異較大，此結果與指紋圖譜及聚類分析結果一致。

3 討論

對于白芍的研究大多集中在醇提液，極少對直接應用于臨床的標準煎液進行研究，本研究選用標準煎液進行研究，標準煎液的制備參考中藥飲片標準湯劑研究策略中標準湯劑的制備方法，使用玻璃器皿提取，提取過程使用冷凝設備進行回流，提高提取效率[8]。且本研究將指紋圖譜與含量測定相結合，既對其中的主要成分進行定量，又兼顧中藥發揮藥效的整體性，更能準確評價白芍質量。

表4 不同加工方式亳白芍標準煎液7種成分含量

注：與亳白芍傳統片比較，*P<0.05；與亳白芍趁鮮片比較，#P<0.05

亳白芍生斜片中除被視為無效成分甚至有害成分的苯甲酸較高外，其余6種成分含量均低于白芍傳統片，說明煮制可升高白芍中多種成分含量，同時又可降低白芍中苯甲酸含量[9-10]。在海外廣泛應用的亳白芍生斜片的藥效及其藥效基礎尚不甚清晰，其能否同白芍傳統片一并應用于臨床尚需進一步研究。

在白芍主產地推廣產地加工與炮制一體化加工模式，將分散無序的藥農或作坊式加工模式轉變為統一在企業進行加工，使白芍加工更加規范，有利于提高白芍飲片質量[11]。從指紋圖譜和多種成分含量的比較來看，亳白芍趁鮮片質量并不低于亳白芍傳統片，但相關規定中暫未將其趁鮮加工合法化，阻礙了趁鮮加工及產地加工與炮制一體化技術的發展。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015:105.

[2] 安徽省食品藥品監督管理局.安徽省中藥飲片炮制規范(2005)[M].合肥:安徽科學技術出版社,2005:113.

[3] 尹雪,孫萍,溫學森.白芍中芍藥苷含量影響因素研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報,2016,18(2):78-80.

[4] 李凱,梁勇,劉磐,等.不同軟化方法對白芍飲片質量的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(3):20-22.

[5] 徐建中,孫乙銘,俞旭平,等.杭白芍產地加工炮制一體化技術研究[J].中國中藥雜志,2014,39(13):2504-2508.

[6] 李偉銘,趙月然,楊燕云,等.HPLC波長切換法同時測定白芍飲片中9個成分的含量[J].藥物分析雜志,2011,31(12):2208-2212.

[7] 陳海燕,冷曉紅,王秀芬,等.寧夏六盤山區栽培白芍的主要成分含量研究[J].西北藥學雜志,2017,32(3):273-275.

[8] 陳士林,劉安,李琦,等.中藥飲片標準湯劑研究策略[J].中國中藥雜志,2016,41(8):1371-1373.

[9] 王康才,張榮榮,方陣,等.杭白芍不同加工品苯甲酸含量分析[J].中藥材,2008, 31(10):1476-1478.

[10] 許源,劉培,嚴輝,等.白芍初加工過程中單萜苷類及多羥基化合物的變化分析[J].中藥材,2014, 37(5):775.

[11] 楊俊杰,李林,季德,等.中藥材產地加工與炮制一體化的歷史沿革與現代研究探討[J].中草藥,2016,47(15):2751-2757.