不同白油佐劑制備的H9N2滅活疫苗在SPF雞上的免疫效果初試驗

董偉峰

（山東萊州市文昌路畜牧獸醫站，山東 萊州 261400)

禽流感 (Avian influenza，AI)H9N2是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒 (Avian influenza，AIV)所引起的禽類疾病[1]。該病主要通過呼吸道傳播，H9亞型禽流感病毒感染雞群后，會造成商品肉雞大面積的呼吸系統疾病，同時也會嚴重影響產蛋雞的生殖系統，導致產蛋雞群的產蛋量大幅下降，且病程較長，發生感染時，死亡率增加，藥物治療效果不佳，給養殖業造成嚴重的經濟損失[2]。目前我國用于禽流感H9N2防控的疫苗多為滅活疫苗，所采用的佐劑多數為注射用礦物白油佐劑，但不同廠家生產的注射用白油佐劑粘度和純度等質量不一，因而其應激、免疫吸收和抗體消長效果差異較大[3,4]。本試驗選擇3個不同廠家注射用礦物白油佐劑樣品，嚴格按照油乳劑滅活疫苗制造與檢驗規程標準，進行H9N2滅活疫苗的制備與檢驗[5]。將檢驗合格的不同廠家注射用礦物白油佐劑滅活疫苗進行SPF雞免疫效果試驗，對免疫雞進行采血分離血清檢測抗體效價，同時剖檢觀察注射部位藥物吸收、殘留情況，通過比較不同廠家注射用礦物白油佐劑的免疫效果差異，為獸醫生物制品行業選用合適的礦物白油提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 礦物白油佐劑 不同場家注射用白油型號分別為 WG40、WG50、DDE170，由國內兩家不同代理商提供。

1.2 病毒滅活液與標準血清 各項檢驗合格的雞H9N2病毒滅活液由山東省農業科學院家禽研究所無特定病原雞研究室提供。標準H9N2陽性抗原、標準H9N2陽性血清、標準陰性血清由哈爾濱獸醫研究所提供。

1.3 培養基和藥品 需氧菌培養基、厭氧菌培養基、霉菌培養基等常用培養基由山東省農業科學院家禽研究所制備和保存；吐溫-80、司本-80由廣州市華南農大生物藥品有限公司提供。

1.4 試驗材料及設備 28日齡SPF雞，由山東省農業科學院家禽研究所無特定病原雞研究室提供；FA25型剪切機，上海弗魯克公司生產；禽用負壓隔離器，蘇州安泰公司生產。

1.5 不同廠家注射用礦物白油質量檢測 相對密度、運動粘度、稠環芳烴、重金屬含量按照《中華人民共和國獸藥典》（2010版）的相關規定方法進行檢驗[6]。

1.6 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗制備與檢驗 按照油乳劑滅活疫苗的相關規定方法進行制備與檢驗[6]，每個白油樣品制備油乳劑滅活疫苗各250ml。

1.7 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫效果試驗 每個白油樣品H9N2油乳劑滅活疫苗分別以0.3ml/只劑量，胸部肌肉注射接種28日齡SPF 雞 30 只， 于接種后 14、21、28、35、42d 分別無菌采血10只雞進行血清抗體（HI）效價檢測。同時每組撲殺5只雞進行疫苗的藥物殘留吸收檢查。

2 結果與分析

2.1 注射礦物白油質量檢測結果 不同廠家注射用礦物白油質量檢測項目與數據結果見表1。

表1 不同廠家注射用礦物白油質量檢驗結果

由表1可知，對照《中華人民共和國獸藥典》的質量標準：運動粘度＜7.0的是礦物白油WG40；三種白油稠環芳烴含量吸光度均小于0.10；重金屬含量3種白油均ppm＜10。

2.2 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗的檢驗結果 3種注射用礦物白油佐劑配制的H9N2滅活疫苗檢驗結果：物理性狀檢驗合格；疫苗粘度分別是 WG40 為 1.7s、WG50 為 2.3s、DDE170 為 2.5s；無菌檢驗、安全檢驗均合格。

2.3 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫藥物吸收、殘留剖檢結果 見表2。

表2 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗胸部肌肉注射藥物吸收、殘留剖檢結果

由表2可知，經過5次注射部位剖檢檢查藥物殘留情況綜合統計，結果顯示其白油佐劑吸收較好的順序是：WG40＞WG50＞DDE170。

2.4 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫HI抗體檢測結果 見圖1。

圖1 不同礦物白油H9N2滅活疫苗免疫抗體消長曲線

將5次血清抗體檢測數據繪成由圖1可知：不同礦物白油樣品H9N2滅活疫苗抗體監測平均值比較發現，WG40 在接種后 14、21、28、35、42d 的抗體均比WG50和DDE170高，且抗體上升快。而WG50和DDE170組在整個免疫期抗體差異不大，從抗體水平看，WG40白油適合用于H9N2油乳劑疫苗的佐劑。

3 討論

免疫佐劑是指與抗原同時或先于抗原使用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力或改變免疫反應類型的物質[7]。選擇佐劑時不僅要考慮其免疫促進作用，也要兼顧佐劑的安全性及佐劑與抗原適當比例配制后疫苗的粘度、穩定性等是否符合要求。目前，滅活疫苗尤其是禽用滅活疫苗，通常使用的佐劑是礦物油佐劑，抗體滴度維持時間較長。但是，不同油佐劑對疫苗免疫效果的增強作用可能存在差異[8]。

本試驗選擇了3種進口油佐劑，與禽流感(H9N2亞型)病毒液配制成滅活疫苗，免疫接種28日齡的SPF雞均未出現局部腫塊及不良反應，說明3種佐劑的生物兼容性較好，易吸收，無毒副作用。經試驗，3種進口油佐劑配制的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗免疫28日齡的SPF雞進行效力檢驗結果顯示，不同佐劑制備的滅活疫苗的抗體效價確實存在明顯差異，只有WG40作為佐劑

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電話：（0531）85990243；85975852的疫苗，免疫后2周H9N2流感病毒的抗體達到合格水平，其余佐劑則在免疫3周后才能達到合格水平。實驗結果認為WG40白油可以作為30日齡左右育成雞的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗的理想佐劑，但是以WG40為佐劑的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗在產蛋禽上的實際應用效果還有待進一步試驗驗證。

參考文獻：

[1] 陳伯倫,張澤紀,陳偉斌.禽流感研究 I.雞 A型禽流感病毒的分離與血清學初步鑒定 [J].中國獸醫雜志,1994(10)∶3-5.

[2] 唐秀英,付朝陽.H9亞型禽流感的流行與防制[J].預防獸醫學進展,2000(4)∶1-3.

[3] 李明義,范根成,杜元釗,等.禽流感(H5、H9亞型)二價油乳劑滅活疫苗試驗研究[J].中國動物檢疫,2005,22(4)∶22-24.

[4] 白軍,劉淑紅.H9亞型禽流感疫苗研究進展[J].畜牧與 飼 料 科 學,2016(11)∶102-103.

[5] 喬榮岑,習向鋒,孫進忠,等.雞新城疫、H9亞型禽流感二聯滅活疫苗的制備方法,CN101607084[P].2009.

[6] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].北京：中國農業出版社,2011.

[7] 沈克飛,曹蘭,尹繼剛,等.免疫佐劑研究進展[J].動物醫 學 進 展,2007,28(s1)∶34-36.

[8] 王振輝,慈洪波,武桂梅,等.不同來源注射用白油佐劑免疫效果分析[J].中國家禽,2013,35(19)∶48-50.