飲用某白酒對大鼠腎上腺髓質細胞DβH、NET表達的影響

陳興強，梁文妹，夏白娟，李一欣，李容瑢，尹 丹，李 杰

(貴州醫科大學組織學與胚胎學教研室,貴州貴陽550025）

中國是人口大國，經濟的快速增長帶動了酒類產品消耗量的上升，也使飲酒問題日益突出。全世界每年因不當飲用酒導致330萬例死亡，占所有死亡數的5.9%[1]。不當飲用酒被WHO列入全球過早死亡和致殘的主要危險因素之一，也是導致多種疾病和損傷病癥的重要因素之一[2]。但也有報道，適量飲酒可降低心臟病的發作、動脈粥樣硬化和某些類型卒中以及絕經期婦女骨質疏松的危險[3-4]。目前我國飲酒者已超過5億人，人均酒精飲料消費呈每年遞增13%，如何健康飲酒已是當務之急。

多巴胺-β-羥化酶（Dopamine beta Hydroxylase，DβH）位于腎上腺髓質細胞的嗜鉻顆粒中，可以將多巴胺（Dopamine，DA）轉化成去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE），是兒茶酚胺（Catecholamine，CA）合成過程中的關鍵酶。NE在心血管功能調節、鎮痛和情感調節中起到重要作用，DA可以調控心血管功能和影響精神活動[5]。酒精作為中樞神經系統的抑制劑，飲酒后欣快、興奮表現與DβH水平有關[6]。位于外周神經系統的去甲腎上腺素轉運蛋白(Norepinephrine transporter，NET)分布于交感神經節后纖維支配的組織，如心臟、腎上腺髓質、肝臟，是交感神經神經遞質信號傳導的重要環節，對維持心血管系統正常功能發揮著重要作用[7]。不同的心血管疾病均可伴有交感神經系統異常，而NET的功能變化可能在上述疾病的發生發展中起著重要作用[8-9]。酒類產品作為日常生活中的一種飲品，如何飲酒才能降低或消除其對健康的危害，已經成為眾多學者關注的焦點，但關于飲酒對大鼠腎上腺髓質細胞DβH、NET的影響鮮見報道。本實驗模擬正常人飲酒習慣，采用54%vol董香型白酒制作大鼠飲酒模型，采用免疫組織化學SABC法、蛋白免疫印跡法檢測飲酒后不同劑量和不同時間下大鼠腎上腺髓質細胞中DβH、NET表達水平的變化，旨在為科學健康飲酒提供一定的基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

將健康成年大鼠120只（180～220 g/只）適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組（normal control group，NCG）30只和實驗組（experiment group，EG）90只。實驗組隨機分為4周組（4W）、8周組（8W）、12周組（12W）、16周組（16W）、20周組（20W）各18只大鼠，每組又分為3個劑量組，即低劑量組(Low dose group，LG，0.8 mL/kg·d)、中劑量組(Middle dose group，MG，1.6 mL/kg·d)及高劑量組(High dose group，HG，2.4 mL/kg·d)。各實驗組大鼠分別于每日上午11點及下午5點給予相應劑量的54%vol董香型白酒灌胃1次，直至取材前1天，正常對照組正常喂養。

1.2 取材及標本處理

分別于各取材點麻醉大鼠后處死，取腎上腺組織，部分使用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，制作4 μm連續切片（3張/只，每張間隔56 μm），進行免疫組織化學染色；部分腎上腺組織入液氮20 min后，-80℃保存，以備用作蛋白質免疫印跡測定。

1.3 免疫組織化學SABC法

切片常規化蠟下行入水，常溫10%甲醇-H2O2處理10 min，羊血清（1∶10）常溫下封閉30 min，兔抗NET多克隆抗體（1∶100），兔抗DβH多克隆抗體（1∶150），4 ℃孵育過夜,羊抗兔IgG（1∶100）37 ℃孵育30 min，SABC復合物（1∶100）37 ℃孵育20 min，DAB（中杉金橋）顯色，蘇木精復染胞核約40 s，中性樹脂封片。0.1%PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 蛋白免疫印跡

取保存于-80℃的腎上腺組織100 mg，加入裂解液于玻璃勻漿器中研磨至勻漿狀，12000 r/min、4℃下離心15 min取上清液，即得到蛋白上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒，對所得蛋白上清液進行定量后，5×蛋白上樣緩沖液制樣，沸水煮5 min，-20℃保存備用，行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入兔抗NET多克隆抗體（1∶500）或兔抗DβH多克隆抗體（1∶500），4℃孵育過夜，室溫下二抗孵育1.5 h，TBST洗膜后加入化學發光底物（Millipore公司），經CLINX凝膠成像系統曝光，NET在69 kd處顯示出特異性條帶，DβH在63 kD處顯示出特異性條帶，以β-action的表達水平為內參，目的蛋白的表達量以目的蛋白與內參照蛋白平均光密度的對比值表示。

1.5 圖像分析

隨機取正常對照組及各實驗組大鼠腎上腺切片，各取3例。在40倍物鏡下，每例切片隨機選取5個視野。用Image-Pro plus6.0圖像分析系統檢測腎上腺髓質細胞內NET、DβH陽性細胞的平均光密度。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用SNK及LSD法。數據以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 免疫組織化學結果

光鏡下，DβH、NET免疫反應陽性產物呈棕黃色或棕褐色細顆粒狀，分布于腎上腺髓質細胞胞質中。與正常對照組比較，4W、8W、12W、16W及20W各實驗組腎上腺髓質細胞內DβH、NET免疫染色位置及染色強度未見明顯變化，見圖1、圖2。所有陰性對照組未見陽性反應細胞。

圖1 各組大鼠腎上腺髓質DβH陽性細胞（SABC法，×400）

圖2 各組大鼠腎上腺髓質NET陽性細胞

2.2 圖像分析結果

與正常對照組相比，4W、8W、12W、16W和20W各實驗組腎上腺髓質細胞內DβH陽性細胞的平均光密度值未見明顯變化(P＞0.05)。見表1。

與正常對照組相比，4W、8W、12W、16W和20W各實驗組腎上腺髓質細胞內陽性細胞內NET平均光密度值未見明顯變化(P＞0.05)。見表2。

2.3 蛋白免疫印跡結果及分析

NET、DβH、β-action蛋白分別在69kD、63kD、42kD處顯示出特異性條帶(圖3)。4W、8W、12W、16W及20W各實驗組蛋白表達水平與正常對照組相比，差異無統計學意義（p＞0.05），見圖4、圖5。

3 討論

有研究指出適量飲酒能增強免疫系統功能，對于許多疾病有預防和治療作用等[10]。但是過多的酒精攝入會帶來一定的負效應。NE在腎上腺素交感神經系統的神經傳遞中起重要作用。NE信號升高與酒精、尼古丁、海洛因等多種藥物濫用的發病機制相關[11]。亦有研究顯示DβH在調節酒精相關行為和身體反應中起重要作用[12]。各種應激性刺激可使腎上腺嗜鉻顆粒中DβH活性增高，DβH的活性可以反映腎上腺髓質的功能狀態。DβH能有效地將DA轉化為NE。當DβH活性降低時，DA/NE比例升高，強烈激活DA受體，從而不能負反饋調節NE合成[13]。臨床研究表明，酒精攝入量與NE有關，急性酒精攝入會影響NE水平，表明NE可能在急性酒精中毒過程中發揮作用[11]。過量飲酒激發了個體的應激反應，激活體內的交感-腎上腺髓質系統，促使兒茶酚胺類物質的釋放，最終引起心率增加、血壓升高。NET屬于單胺類Na+、Cl-依賴性轉運蛋白,其功能是將神經元釋放的NE再攝取回到突觸前膜中，對調控突觸間隙中NE濃度、終止神經沖動信號、維持受體對神經遞質的敏感性極為重要[14]。有研究報道，在腎上腺髓質細胞中，NET只存在于去甲腎上腺素能細胞中[15]。酒精主要作用于單胺類轉運體，通過阻止轉運體對神經遞質的重吸收，從而增強神經遞質的興奮作用[16]。

表1 各組大鼠腎上腺髓質DβH陽性細胞的平均光密度值 (±s)

表1 各組大鼠腎上腺髓質DβH陽性細胞的平均光密度值 (±s)

組別4 W 8 W 12 W 16 W 20 W腎上腺髓質DβH陽性細胞平均光密度NCG 0.247±0.012 0.240±0.017 0.248±0.013 0.239±0.013 0.240±0.016 LG 0.220±0.019 0.210±0.011 0.226±0.010 0.233±0.011 0.233±0.015 MG 0.218±0.013 0.207±0.012 0.222±0.012 0.236±0.014 0.231±0.014 HG 0.210±0.013 0.210±0.012 0.220±0.011 0.236±0.017 0.231±0.019

表2 各組大鼠腎上腺髓質NET陽性細胞的平均光密度值 (±s)

表2 各組大鼠腎上腺髓質NET陽性細胞的平均光密度值 (±s)

組別4 W 8 W 12 W 16 W 20 W腎上腺髓質NET陽性細胞平均光密度NCG 0.269±0.016 0.263±0.013 0.267±0.013 0.270±0.013 0.254±0.013 LG 0.236±0.017 0.211±0.012 0.236±0.012 0.269±0.013 0.279±0.013 MG 0.226±0.013 0.229±0.013 0.247±0.012 0.258±0.014 0.287±0.014 HG 0.227±0.015 0.229±0.015 0.236±0.017 0.270±0.012 0.260±0.012

圖3 各組腎上腺髓質蛋白表達

圖4 正常對照組及不同劑量白酒灌胃各組大鼠腎上腺組織勻漿中DβH的表達

圖5 正常對照組及不同劑量白酒灌胃各組大鼠腎上腺組織勻漿中NET的表達

本實驗大鼠每次灌胃劑量分為低劑量組0.8 mL/kg·d、中劑量組 1.6 mL/kg·d及高劑量組2.4 mL/kg·d，通過單位換算，相當于正常成年人（60 kg）每日7.8 mL、15.6 mL及23.4 mL的飲酒劑量。在本實驗設計的劑量下，用該白酒灌胃后，實驗組動物腎上腺髓質細胞DβH、NET表達水平對比正常組沒有顯著改變。課題組前期研究成果亦表明，在該劑量下該白酒對大鼠肝細胞、胰島B細胞的表達無明顯影響[17-18]。提示在此劑量下用該白酒灌胃對大鼠腎上腺髓質細胞功能而言屬于適量飲酒。

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