木糖渣發酵制備乙醇

岳 軍，屈海峰，胡世洋，徐友海，寧艷春，惠繼星，王繼艷，金 剛

（中國石油吉林石化公司研究院，吉林吉林132021）

自人類進入工業社會以來，資源環境問題日益突出，尤其是不可再生的化石能源的大量使用，排放大量二氧化碳所導致的溫室效應，已經成為不可回避的重大問題[1]。能源與資源的可再生化與環境友好化是未來轉型升級的方向。

2017年9月13日,國家發改委、國家能源局、財政部等十五部委聯合印發《關于擴大生物燃料乙醇生產和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》，根據方案要求，到2020年，我國全國范圍將推廣使用車用乙醇汽油，到2025年，力爭纖維素乙醇實現規模化生產，該方案的出臺對于纖維素乙醇的推廣有重大的意義。

木質纖維素材料是光合作用的產物，產量巨大而且可再生，可以用作生產液體燃料的原料，成為化石能源的潛在替代品，受到了全世界的廣泛關注[2-3]。目前，以農作物秸稈為代表的木質纖維素材料，由于沒有合適的應用途徑，大多以堆積、焚燒等形式直接處理，不僅資源浪費，而且造成了嚴重的環境問題，引起了公眾的密切關注[4-5]。以木質纖維素生產燃料乙醇是解決秸稈焚燒以及減少二氧化碳排放的有效途徑。以玉米秸稈為原料制備燃料乙醇為例，與同等體積的汽油相比，二氧化碳排放量要減少70%以上[6]。

木糖渣是玉米芯提取木糖后的廢渣，其纖維素含量可以達到60%～70%之間，由于大部分半纖維素已經被脫除，纖維素的轉化率大幅度的提高，可以作為發酵產乙醇的原料[7-8]。但是與淀粉質原料相比，使用木質纖維素材料發酵產乙醇還存在諸多的問題，其中之一便是發酵醪液中的乙醇濃度較低，蒸餾過程中的能耗大[9]。木糖渣作為玉米芯生物煉制的典型材料，其應用模式對于其他農作物秸稈而言具有一定的借鑒意義。已有文獻研究了木糖渣發酵產乙醇的過程，取得了一定的效果，但還存在諸如發酵周期長、乙醇濃度低的問題；有研究以水解液作為發酵原料，雖然可縮短發酵周期，但操作過程較為繁瑣[10-11]。因此仍需對木糖渣發酵生產乙醇的過程進行進一步研究，提高發酵醪液中的乙醇濃度。

本研究以木糖渣為原料，研究了底物濃度、酶用量對于乙醇濃度的影響，在此基礎上，采用補料發酵進一步提高底物濃度，研究了不同補料次數、補料量對于乙醇濃度的影響，對于木糖渣生產燃料乙醇的進一步推廣具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

木糖渣：山東龍力生物科技有限公司，自然風干后，儲存于自封袋中，平衡水分24 h后備用。

纖維素酶：上海寶曼生物科技有限公司，濾紙酶活162.7 FPU/g，β-葡萄糖苷酶酶活40.9 IU/g。

釀酒活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；實驗過程中所用的酵母粉、蛋白胨為生化試劑，乙醇、濃硫酸等化學試劑皆為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 同步糖化發酵

將1.0g干酵母及100mL無菌水分別置于300mL三角瓶中，于30℃、180 r/min下活化2 h。活化結束后，取5 mL酵母活化液接入300 mL裝有已滅菌木糖渣的三角瓶中（三角瓶中除含有木糖渣外，還包括45 mL含有10.0 g/L蛋白胨、5.0 g/L酵母抽提物的水溶液），并按照實驗所需酶用量加入纖維素酶，用錫箔紙封口后，于30℃、180 r/min下進行同步糖化發酵，測定乙醇濃度，并計算纖維素轉化率，公式如下。

1.2.2 半同步糖化發酵

稱取5 g木糖渣于250 mL三角瓶中，加入45 mL去離子水，0.5 g蛋白胨及0.25 g酵母抽提物，121℃滅菌并降至室溫后，向三角瓶中加入纖維素酶。錫箔紙封口后將三角瓶置于50℃振蕩培養箱中，以180 r/min酶解糖化48 h，每隔24 h取樣并進行補料，采用高效液相色譜(HPLC)測定水解液中葡萄糖的濃度。48 h后將溫度設置為30℃，三角瓶溫度降至室溫后，加入酵母活化液5 mL，放置于30℃培養箱中進行補料同步糖化發酵，期間每隔24 h取樣，并分析樣品中的葡萄糖及乙醇濃度。

1.2.3 分析和測定方法

木糖渣化學組分的測定：木糖渣中水分、木質素、纖維素等組分含量按文獻中所述方法進行測定[12]。

酶解液或發酵液中葡萄糖和乙醇濃度的測定：吸取木糖渣水解液或是發酵液，以10000 r/min離心5 min后，用去離子水將上清液稀釋到一定倍數，采用液相色譜進行測定。

高效液相色譜分析條件：儀器LC20A(日本島津)，流動相：0.005 mol/L硫酸溶液，色譜柱bio-rad HPX 87H，流速：0.6 mL/min，柱溫：55 ℃，檢測器：RID 10A。

2 結果與討論

2.1 酶用量影響

將纖維素轉化為可發酵性糖的過程中，纖維素酶起著關鍵作用。如何降低酶水解過程中纖維素酶的成本是纖維素乙醇大規模商業化生產需要解決的問題之一。酶的現場生產以及開發更高效的酶制劑是有效的解決方案[13-14]，而對于特定底物而言，研究酶用量的影響，在保證較高轉化率的前提下，盡量減少纖維素酶的用量也可以在一定程度上降低酶用量。

以木糖渣為底物，發酵底物濃度為10 g/100 mL，纖維素酶在發酵初期添加，采用同步糖化發酵，對比了不同酶用量對乙醇濃度的影響，結果見圖1。圖1表明,在不同的發酵時間點，發酵液中的乙醇濃度隨著酶用量的增加而相應增加。酶用量由15 FPU/g底物增加到35 FPU/g底物，發酵24 h乙醇濃度由8.3 g/L增加到24.4 g/L，發酵48 h乙醇濃度由19.0 g/L增加到31.0 g/L，發酵72 h乙醇濃度由22.5 g/L增加到32.0 g/L。當酶用量由20 FPU/g底物增加到35 FPU/g底物，發酵時間分別為24 h與48 h時，發酵液中的乙醇濃度差異明顯；發酵時間分別為48 h與72 h時，乙醇濃度的差異不大，表明發酵48 h時大部分纖維素已經被降解為酵母可以利用的發酵性糖，并被進一步轉化為乙醇。因此當底物濃度為10 g/100 mL時，酶用量達到20 FPU/g底物以上，發酵時間以48 h較為適宜。

采用origin8.0對發酵48 h時，酶用量與乙醇濃度進行了擬合，結果如圖2所示，擬合方程為y=-0.028x2+1.988x-3.929（其中y為乙醇濃度，x為酶用量），擬合模型的p值為0.02，相關系數R2為0.955表明該方程擬合良好，可以對結果進行很好的預測。

圖1 酶用量對乙醇濃度的影響

圖2 發酵48 h酶用量與乙醇濃度的擬合

2.2 底物濃度的影響

在乙醇蒸餾過程中，乙醇濃度對于蒸餾能量的消耗有顯著性的影響，當發酵液中乙醇體積分數低于5%時，蒸餾過程中消耗的能量將大大增加，為了降低蒸餾過程中的能耗，發酵液中的乙醇濃度需要增加到5%以上[15]。由于木質纖維素類物質密度小，吸水性強，纖維素酶水解效率低，顯然提高底物濃度以增加發酵液中的乙醇濃度是必然選擇[16]。

以木糖渣為底物，酶用量為20 FPU/g底物，對比了底物濃度分別為5.0 g/100 mL、10.0 g/100 mL、15.0 g/100 mL、20.0 g/100 mL對乙醇濃度的影響，結果見圖3。從圖3可以看出，在上述底物濃度下，發酵時間由48 h增加到72 h時，乙醇濃度變化較小，表明在底物濃度不變的情況下，發酵48 h即可。當底物濃度由5.0 g/100 mL增加到20.0 g/100 mL時，各發酵時間點乙醇濃度呈逐漸增加的趨勢，發酵96 h時乙醇濃度分別為12.1 g/L、29.0 g/L、38.5 g/L、37.5g/L。底物濃度由5.0g/100mL增加到15.0g/100mL時，乙醇濃度增加較多，而底物濃度由15.0 g/100 mL增加到20.0 g/100 mL時，每個發酵時間點的乙醇濃度均相差不大。單位底物酶用量相同，底物濃度增加到20.0 g/100 mL情況下，乙醇濃度增加較少，原因可能是在底物濃度為20.0 g/100 mL時，發酵液的黏度過大，傳質效率下降。進一步比較了96 h時，4種底物濃度下，纖維素轉化率的變化，結果見表1。由表1可知，當底物濃度增加到20.0 g/100 mL時，轉化率已經由最高的87.1%下降到了56.3%,表明單位底物酶用量相同時，底物濃度增加后轉化率下降。此外還發現，與酶用量對乙醇濃度影響的結果相類似，當底物濃度固定不變時，發酵48 h乙醇濃度已經接近最高值（圖3），從提高發酵效率角度來看，發酵48 h較為適宜。

圖3 底物濃度對乙醇濃度的影響

表1 發酵96 h底物濃度與纖維素轉化率的對比

2.3 補料次數的影響

纖維素乙醇發酵過程中，由于一次性加料容易造成底物濃度過高而導致傳質效率的下降，在發酵起始時底物濃度不宜過高。實現纖維素乙醇發酵的高乙醇濃度，需要在發酵過程中分批次添加發酵底物，從而逐步增加底物濃度。

以木糖渣為底物，酶用量為20 FPU/g底物，纖維素酶在發酵初始時添加，起始底物濃度為15.0 g/100 mL，對比了補料次數對乙醇濃度的影響，結果見圖4。補料次數分別為1～5次，補料間隔時間為24 h，每次補相同質量的木糖渣，120 h時所有試驗組中的總底物濃度均達到30.0 g/100 mL，具體補料情況見表2。從圖4可看出,發酵時間分別為24 h、48 h、72 h時各試驗組的乙醇濃度相差不大。發酵120 h時各補料試驗組的乙醇濃度均達到最大，其中最高的是補料次數為2次的試驗組，乙醇濃度達到70.0 g/L。為了進一步研究補料次數對乙醇濃度的影響，對不同發酵時間下補料次數對乙醇濃度的影響進行了方差分析，結果見表3。從表3可以看出，發酵時間從24 h延長到192 h，p值均大于0.05，表明在起始底物濃度一致、酶用量相同、終補料濃度相同的情況下，分別進行不同次數的補料對乙醇濃度并沒有顯著性的影響。

圖4 補料次數對乙醇濃度的影響

表2 不同補料次數的補料操作情況

為了進一步的對比不同補料次數對乙醇發酵的影響，分析了在不同發酵時間點、補料次數對轉化率的影響，結果見圖5。從圖5可以看出，發酵時間分別為48 h、72 h時，隨著補料次數的增加，轉化率也隨之增加，以發酵72 h為例，轉化率最高的是補料次數為5次的試驗組，其轉化率為67.3%，隨著補料次數的減少，轉化率依次為65.2%、58.6%、52.2%、51.2%。

表3 補料次數對乙醇濃度影響的方差分析

圖5 補料次數對轉化率的影響

進行1次補料，24 h其纖維素轉化率為45.8%，24 h補料后，48 h轉化率降低到37.8%，48 h之后逐漸上升；進行2次補料，補料時間分別在24 h、48 h，其相應的轉化率為38.8%、53.5%，72 h時轉化率為52.1%；進行3次補料，補料時間分別為24 h、48 h、72 h，其相應的轉化率為42.2%、56.2%、58.6%，96 h時轉化率為56.2%。從所列舉的數據可以看出，補料次數分別為第1次及第2次時補料后的轉化率有所下降，其中的原因是，補料后底物的量增加速度過快，而纖維素酶水解纖維素的速度隨著時間的延長而逐漸下降[17]，增加的底物并不能很快的被纖維素酶降解成酵母可利用的葡萄糖。當補料次數為4次與5次時，96 h之前轉化率是逐漸增加的，96 h之后呈下降趨勢，所補的底物已不能被完全酶解，若發酵時間延長至144 h之后，補料次數對于轉化率的影響不顯著。

2.4 補料量的影響

以木糖渣為底物，起始濃度為15.0 g/100 mL，纖維素酶的用量為15 FPU/g底物，24 h后進行補料，具體補料的情況見表4，補料后總底物濃度分別為40.0 g/100 mL、50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL，研究了不同補料量對乙醇濃度的影響，結果見圖6。從圖6可以看出，發酵時間96 h，3種補料量的乙醇濃度差異不大，96 h之后乙醇濃度有所下降，下降最大的是底物濃度為50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL的試驗組，發酵168 h時乙醇濃度僅為53.2 g/L、51.5 g/L。

表4 不同補料量的補料操作情況

圖6 補料量對乙醇濃度的影響

值得注意的是3種底物濃度下，發酵液中的葡萄糖均呈上升趨勢。發酵168 h時，葡萄糖濃度分別為9.0 g/L、19.4 g/L、20.8 g/L，表明在發酵后期，酵母活性下降，不能將酶水解產生的葡萄糖轉化為乙醇。原因可能是補料后，隨著酶水解的進行，酚類物質逐漸被釋放出來，其濃度不斷增加，抑制了酵母活性[18]。

進一步比較了酶用量為20 FPU/g底物，總底物濃度為40.0 g/100 mL的乙醇發酵情況，酶用量由15 FPU/g底物增加到20 FPU/g底物時，96 h乙醇濃度由64.9 g/L增加到75.8 g/L。發酵168 h時葡萄糖也有積累，濃度為7.8 g/L（圖6）。

2.5 木糖渣的半同步糖化發酵

由于纖維素酶酶解木質纖維素材料的最適溫度與酵母生長最適溫度的差異性，同步糖化發酵時，溫度只能為適宜于酵母生長的溫度。在此條件下纖維素酶的水解效率較低，高底物濃度的纖維素乙醇發酵過程中，會降低纖維素的轉化率并延長發酵時間。半同步糖化發酵，首先進行預糖化，預糖化一段時間后，進行同步糖化發酵。此發酵方式，將分步糖化發酵與同步糖化發酵兩種方式的優點結合起來，可在一定程度上避免因發酵溫度低而造成的纖維素轉化率下降的問題，可以提高纖維素的轉化率并縮短發酵的周期[19]。

以木糖渣為底物，酶用量為20 FPU/g底物，起始底物濃度為15.0 g/100 mL，首先于50℃下進行預糖化48 h，后進行補料同步糖化發酵，補料情況見表5。半同步糖化發酵情況見圖7。圖7表明，預糖化24 h時，葡萄糖濃度為13.1 g/L，48 h時葡萄糖濃度為14.4 g/L。依照理論值計算，預糖化24 h時，乙醇濃度僅能達到6.7 g/L，而相應條件下的同步糖化發酵24 h時的乙醇濃度可以達到20.0 g/L以上（圖4、圖6數據）。預糖化48 h時接種酵母，于30℃進行同步糖化發酵，96 h時的乙醇濃度為16.9 g/L，而同步糖化發酵96 h時的乙醇濃度可以達到50.0 g/L以上（圖4、圖6數據），半同步糖化發酵效果不佳。與同步糖化發酵相比，采用預糖化并沒有增加體系中的葡萄糖濃度，具體原因還有待進一步的分析。而文獻報道中，采用半同步糖化發酵可以有效提高纖維素的轉化率及乙醇濃度[18-21]，本試驗以木糖渣的研究中并沒有取得與文獻報道相一致的結果。

表5 半同步糖化發酵補料操作情況

3 結論

圖7 半同步糖化發酵

3.1 纖維素酶用量與底物濃度相同的情況下，發酵48 h時，乙醇濃度可以達到較高的水平；酶用量為20 FPU/g底物，底物濃度為15.0 g/100 mL與20.0 g/100 mL，乙醇濃度差異不明顯。

3.2 底物濃度大于10 g/100 mL時，單位底物酶用量保持不變，底物濃度繼續增加后纖維素轉化率下降。

3.3 酶用量為20 FPU/g底物，起始底物濃度為15.0 g/100 mL，通過不同的補料次數（1～5次），補料到最終底物濃度為30.0 g/100 mL時，在95%置信水平，補料次數對乙醇濃度沒有顯著性影響。

3.4 酶用量為15 FPU/g底物，起始底物濃度為15.0 g/100 mL，通過增加補料量到40.0 g/100 mL、50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL，乙醇濃度并不能隨著底物濃度的增加而增加。不同補料量下，在96 h時乙醇濃度達到最大，96 h后發酵液中的葡萄糖濃度不斷增加。酶用量為20 FPU/g底物時，補料到最終底物濃度為40.0 g/100 mL，96 h時乙醇濃度達到75.8 g/L。

3.5 本研究的實驗條件下，與同步糖化發酵相比，半同步糖化發酵乙醇濃度明顯低于同步糖化發酵，半同步糖化發酵不能提高乙醇濃度及纖維素轉化率，其中原因還有待進一步研究。

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