大曲中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的高效液相色譜檢測方法

周韓玲，廖勤儉，安明哲，李楊華，郭 艷

(四川宜賓五糧液股份有限公司技術研究中心，四川宜賓644007)

γ-氨基丁酸，簡稱GABA，是一種廣泛分布于動植物、微生物體內的非蛋白動能性氨基酸。它參與多種代謝活動，具有很高的生理活性，是神經中樞重要的抑制性氨基酸遞質。醫學上，可用于肝昏迷及腦代謝障礙，還可以抗神經不安，是對抗抑郁焦慮、改善情緒、緩解壓力、促進睡眠、提高腦活動、解毒醒酒的一種純天然物質，也是一種新型的功能因子。

隨著業界對γ-氨基丁酸研究的深入，微生物發酵法生產γ-氨基丁酸已經成為研究熱點，如乳酸桿菌發酵生產γ-氨基丁酸的研究[1]。大曲是糧食原料網羅自然微生物自然發酵而成，其中含有豐富的微生物、酶系及發酵產物，是釀造白酒的糖化發酵劑，同時，對白酒香味成分也有很大的貢獻。γ-氨基丁酸主要來源于L-谷氨酸的脫羧反應，由此，研究檢測大曲中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，對研究大曲中代謝γ-氨基丁酸的微生物以及釀酒發酵過程中L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的生成變化，具有一定的指導意義。

此前的文獻資料中，對γ-氨基丁酸的檢測也有報道，如利用高效液相色譜、柱前衍生、紫外檢測方式來測定發芽糙米中的γ-氨基丁酸，其中γ-氨基丁酸的提取方式為乙醇水混合溶液回流萃提[2]；測定腦脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸，同樣采取紫外檢測方式，其中目標物的提取方式也比較復雜[3]。紫外檢測器選擇性較低，對于基質復雜的樣品，在色譜定性和定量上會出現不準確。針對大曲樣品中復雜的化學成分，通過自動柱前衍生方式，利用熒光檢測器進行L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的檢測，其優勢在于樣品無需復雜的前處理，靈敏度高，穩定性、重復性好。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

樣品：釀酒生產用大曲。

儀器設備：美國Agilent公司1100系列高效液相色譜儀(HPLC)，FLD檢測器，離心機，振蕩器。

耗材：L-谷氨酸和γ-氨基丁酸標準品，自購。

1.2 色譜條件

分析柱：Agilent HypersilAA-ODS 2.1×200 mm 5-micron。

流動相：A，甲醇（色譜級）；D，20 mmol乙酸鈉，0.018%三乙胺調pH7.2后，加入0.3%的四氫呋喃。

梯度洗脫：0～2 min，100 D～100 D；25 min，65 D；30 min，0 D；35 min，0 D；36 min，100 D；40 min，100 D；40 min，stop。

柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min。進樣程序：抽取5.0 μL緩沖液。

從樣品瓶抽取1.0 μL；將6.0 μL混合到空氣，最大速度，2次；抽取0 μL水洗針液；抽取1.0 μL的OPA衍生試劑；將6.0 μL混合到空氣中，最大速度，6次；抽取0 μL水洗針液；抽取64 μL水；將36 μL混合到空氣，最大速度，2次；進樣。

1.3 標準品的配制

精確稱取γ-氨基丁酸和L-谷氨酸，以0.1 mol/L的HCl水溶液配制成50 mL濃度為1000 mg/L的標準儲備液，放置于4℃下冷藏。

1.4 樣品處理

稱取5份粉碎后的大曲粉末（每份1.00 g），分別置于5支15 mL離心管中，向第1支離心管中加入10 mL甲醇，第2支離心管中加入10 mL 75%甲醇水溶液，第3支離心管中加入10 mL50%甲醇水溶液，第4支離心管中加入10 mL 25%甲醇水溶液，第5支離心管中加入10 mL 0.1 mol/L的HCl水溶液，每支離心管振蕩提取10 min，離心，取上清液0.1mL，用0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至1 mL，經0.22 μm濾膜過濾后進液相色譜儀分析。

2 結果與分析

2.1 標樣和樣品的定性檢測

取1000 mg/L的標準溶液，0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至濃度為2.0 mg/L，進行定性檢測，L-谷氨酸出峰時間為2.2 min，γ-氨基丁酸出峰時間為22.2 min。大曲樣品處理方式見1.5，標樣色譜圖見圖1，樣品色譜圖見圖2。

圖1 標準品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.2 標準曲線及線性范圍

取標準儲備溶液，0.1 mol/L的HCl水溶液稀釋至 120 μg/L、360 μg/L、1200 μg/L、3600 μg/L、12000 μg/L共5個濃度梯度，作為定量分析校正。以峰面積Y為縱坐標，以質量濃度（μg/L）為X橫坐標，繪制標準曲線，結果表明，在120～12000 μg/L范圍內，線性相關系數較好，能準確定量分析大曲中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸含量。回歸方程、線性相關系數及方法定量限見表1。

表1 方法回歸方程、相關系數及定量限

表2 精密度試驗結果(n=6)

2.3 樣品中氨基酸提取方法優化結果

采用不同方法提取曲粉中的L-谷氨酸與γ-氨基丁酸，結果見圖3、圖4。

圖3 不同方法提取曲藥中L-谷氨酸結果（μg/L）

圖4 不同方法提取曲藥中γ-氨基丁酸結果（μg/L）

從圖3、圖4可看出，采用甲醇作為提取液時，曲藥中氨基酸提取率較低，采用甲醇水溶液和0.1 moL/L HCl作為提取液時，效果明顯好于純甲醇，當甲醇水溶液濃度為75%時，曲藥中L-谷氨酸及γ-氨基丁酸提取率最高，加之甲醇濃度越高，曲藥浸泡液中糖類物質越少，對氨基酸檢測干擾也越小，所以，最后選擇75%甲醇水溶液作為提取液。

2.4 精密度試驗

采用75%甲醇水溶液作為提取液，提取曲粉中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸，對同一樣品平行測定6次，得到γ-氨基丁酸的檢測結果的相對標準偏差（RSD）為1.59%～1.72%，滿足分析要求，結果見表2。

2.5 加標回收率試驗

取大曲樣品3份，采用75%甲醇水溶液作為提取液，其中1份作為空白本底值，另外2份大曲稱入離心管后，在離心管中分別加入已知量的標準溶液，用上述實驗方法進行回收率試驗。試驗結果表明，化合物的回收率為90.96%～101.49%，滿足分析要求，結果見表3。

表3 樣品中加標回收率結果

3 結論

采用75%甲醇水溶液作為提取液，曲藥中L-谷氨酸與γ-氨基丁酸提取率較高，所建立檢測方法的R2值、精密度、加標回收率等均較好，能準確分析大曲樣品中的L-谷氨酸和γ-氨基丁酸含量。大曲樣品經75%甲醇水溶液振蕩提取，提取液中有機相較高，能抑制大曲中的酶促反應，離心后的上清液如需隔夜檢測，需要冷藏放置。

參考文獻：

[1]劉清,姚慧媛,張暉.生產γ-氨基丁酸的乳酸菌的選育及發酵條件優化[J].氨基酸和生物資源,2004(1)：40-43.

[2]房克敏,李再貴,袁漢成,等.HPLC法測定發芽糙米中的γ-氨基丁酸含量[J].食品科學,2006(4)：208-211.

[3]陳希賢,李東,呂建新,等.高效液相色譜法測定人腦脊液中γ-氨基丁酸和谷氨酸[J].色譜,1997(3)：237-239.