大黃素對大鼠急性脊髓損傷后繼發脊髓水腫的影響

曾歡歡，黃英如，李子健，汪 一，張 松

1.重慶醫科大學中醫藥學院針灸骨傷教研室，重慶市400016；2.中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016

急性脊髓損傷是脊柱外傷與脊柱手術的嚴重并發癥，至今還沒有有效的治療措施[1]。原發性脊髓損傷后數小時至數天內，會出現復雜的繼發性損傷，包括損傷局部脊髓水腫、缺血缺氧、炎癥反應、細胞凋亡、脂質過氧化等[2]。由于受到軟脊膜和硬脊膜等的限制，原發性脊髓損傷后繼發的脊髓水腫，將使得脊髓內壓增高，導致脊髓內微循環障礙，進一步加重脊髓缺血缺氧和細胞死亡等病理變化。減輕/抑制脊髓損傷后的繼發性脊髓水腫程度，保護原發性脊髓損傷后殘存的神經細胞，對急性脊髓損傷后患者肢體功能恢復非常重要。

大黃素是從中藥大黃的干燥根中提取的主要活性單體成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[3-4]。大黃素能調節肺組織水通道蛋白(aquaporin,AQP)-1和AQP-5的表達，減輕急性重癥胰腺炎誘導的肺水腫和盲腸穿孔性敗血癥誘導的肺水腫[5-6]。本實驗觀察大黃素對急性脊髓損傷后繼發性脊髓水腫的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠180只，體質量180～200 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SYXK(渝)2012-0001。在實驗過程中對大鼠的處理均按照國家頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》和重慶醫科大學醫學研究倫理委員會的要求嚴格執行。按照隨機數字表法將大鼠分為假手術組(A組)、模型組(B組)、大黃素低劑量組(20 mg/kg，C組)、大黃素中劑量組(40 mg/kg，D組)和大黃素高劑量組(80 mg/kg，E組)[3,7]，每組36只。

1.2 主要試劑、儀器

大黃素，純度≥98%，產品批號A0044：成都曼思特生物技術有限公司。AQP-4、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)抗體：美國ABCAM公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體：美國NOVUS公司。Trizol試劑，RR047A逆轉錄試劑盒，AQP-4、MMP-2、GAPDH引物：日本TAKARA公司合成。蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin staining,HE)試劑盒：中國索萊寶公司。伊文思藍(Evans blue,EB)染料：美國SIGMA公司。CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統、T100TMPCR儀：美國BIO-RAD公司。凝膠成像系統：美國ODYSSEY-FC公司。BX51正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。低溫高速離心機：德國SIGMA公司。

1.3 動物模型及給藥

2%戊巴比妥鈉溶液30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定，以T10棘突為中心作2 cm切口，剝離筋膜，切開椎板，暴露T10胸髓，采用Allen法以重10 g打擊棒從2.5 cm高度自由落下撞擊于T10胸髓[8]，逐層縫合傷口。打擊后損傷處脊髓出現出血腫脹，致傷瞬間尾部會痙攣性擺動，雙下肢及軀體回縮撲動后，出現雙下肢癱瘓即為造模成功[9]。

A組僅行手術暴露。

術后10 min內，C、D、E組分別腹腔注射大黃素溶液20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，A組、B組腹腔注射等體積生理鹽水。每天1次，共28 d。手術過程嚴格無菌操作，每只大鼠術畢予以20萬U青霉素鈉腹腔注射預防感染，持續3 d；術后每天定時給予3次人工膀胱排尿，直至大鼠能夠自主排尿。

1.4 檢測指標

1.4.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分

術后3 d、7 d、14 d及28 d[10]，每組隨機取6只大鼠進行BBB評分[11-12]。評分由熟悉本實驗評分標準的非本組實驗人員獨立進行，觀察5 min。每只大鼠測3次，取平均值。在評分前被抽取大鼠應檢查其膀胱是否充盈，以免因膀胱充盈而影響評分結果。

1.4.2 斜板實驗

在術后3 d、7 d、14 d及28 d，每組隨機取6只大鼠，將大鼠的身體縱軸放于與木板橫軸垂直的木板上，從水平位置(0°)起逐漸增大木板角度，每次升高5°，以大鼠能夠在木板上停留5 s而不下滑的最大角度作為其神經功能值。實驗評分由熟悉本實驗評分標準的非本組實驗人員獨立進行。

1.4.3 HE染色

術后3 d，每組隨機取3只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于操作臺上，劍突下剪開腹腔，暴露心臟，將灌注針刺入主動脈內，剪開右心耳，用微量泵灌注生理鹽水，直到右心耳流出無色液體后，灌注4%多聚甲醛至四肢僵硬。2 h后，以脊髓損傷點為中心，取出頭側、尾側約0.5 cm脊髓組織，放入4%多聚甲醛浸泡保存。常規石蠟包埋、連續切片，片厚5 μm。進行HE染色，在400倍光學顯微鏡下觀察。

1.4.4 脊髓含水量測定

術后3 d，每組隨機取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后固定，剝離椎旁肌肉，快速取出脊髓組織，以脊髓損傷點為中心，頭側、尾側各留取0.5 cm。取出的脊髓標本立刻稱其濕重，置于80℃烤箱內干燥48 h至恒重，稱其干重；重復測量3次后取均值，計算脊髓組織含水量。

1.4.5 血脊髓屏障(blood-spinal cord barrier,BSCB)通透性檢測

使用EB作為示蹤劑，檢測BSCB通透性變化[13]。術后3 d，各組隨機取6只大鼠，處死前2 h從股靜脈注入2%EB溶液20 mg/kg，觀察大鼠眼睛、足趾變藍后，提示染料分布均勻。以斷頭法處死大鼠，取以損傷點為中心的頭側、尾側2 cm脊髓，放于甲酰胺3 ml中，54℃水浴24 h后取上清，酶標儀在波長632 nm處測量吸光度值，繪制EB標準曲線，根據標準曲線計算EB含量(μg/g)。

1.4.6 AQP-4、MMP-2 mRNA表達

采用反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測 AQP-4、MMP-2 mRNA表達。術后3 d，每組隨機取3只大鼠，取以損傷點為中心的頭側、尾側0.5 cm脊髓組織，Trizol裂解后提取總RNA。檢測RNA濃度及純度后，按RR047A試劑盒操作步驟配制反應體系，放于T100TMPCR儀中進行逆轉錄，根據SYBR Green法配制Mix及反應體系后上機進行反應。運用CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統讀取Ct值。以2-ΔΔCt表示其余四組與假手術組目的基因表達的倍比關系。

重復3次試驗，計算平均值。

上下游引物序列分別見表1。

表1 上下游引物序列

1.4.7 AQP-4、MMP-2蛋白表達

采用Western blotting檢測AQP-4、MMP-2蛋白表達。術后3 d，每組隨機取6只大鼠，2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后固定并快速取出以損傷點為中心頭側、尾側脊髓組織0.5 cm，按1 ml/100 mg比例加入裂解液置于冰上裂解15 min，勻漿后4℃靜置1 h，4℃低溫12000 r/min離心，共15 min，取上清按照BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測濃度，上樣量45 μg，采用Bradford法測定蛋白含量，濃度調定后等體積上樣，10%分離膠，5%濃縮膠，電泳70 V 30 min后100 V 80 min，恒定電流200 mA 180 min轉膜，5%脫脂奶粉封閉90 min，一抗孵育過夜(AQP-4 1∶1000，MMP-2 1∶2000，GAPDH 1∶5000)，二抗孵育 1 h，化學發光儀顯影，用Image J軟件分析各條帶相應值。

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0進行統計分析。數據以(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 BBB評分

術后3 d、7 d、14 d及28 d，B組BBB評分較A組降低(P＜0.05)。術后7 d、14 d、28 d，C組、D組和E組BBB評分均高于B組(P＜0.05)，且E組BBB評分均高于C組和D組(P＜0.05)。術后14 d和28 d，D組BBB評分均高于C組(P＜0.05)。見表2。

2.2 斜板實驗

術后3 d、7 d、14 d及28 d，B組斜板實驗角度較A組降低(P＜0.05)。術后7 d、14 d及28 d，C組、D組和E組斜板實驗角度高于B組(P＜0.05)，且E組斜板實驗角度均高于C組和D組(P＜0.05)。術后14 d和28 d，D組斜板實驗角度均高于C組。見表3。

2.3 HE染色

術后3 d，A組偶見少量炎性細胞核，脊髓組織各形態結構完整，各層細胞排列整齊，無腫脹和出血；B組損傷節段內有大片出血灶，神經細胞腫脹、破壞，大量炎性細胞浸潤，組織間隙增寬，水腫嚴重；而C、D、E組上述病理改變均有所改善，其中E組改善最明顯，神經細胞破壞最輕。見圖1。

2.4 脊髓組織含水量

術后3 d，B組脊髓組織含水量較A組增高(P＜0.05)。D、E組脊髓組織含水量低于B組和C組(P＜0.05)，B組和C組間脊髓組織含水量比較無顯著性差異(P＞0.05)，E組低于D組(P＜0.05)。見表4。

2.5 BSCB通透性

術后3 d，B組EB含量高于A組(P＜0.05)，C組、D組和E組EB含量均低于B組(P＜0.05)，D組和E組低于C組，E組低于D組(P＜0.05)。見表5。

2.6 AQP-4、MMP-2 mRNA表達

術后3 d，B組AQP-4、MMP-2 mRNA表達較A組升高(P＜0.05)，C組、D組和E組AQP-4、MMP-2 mRNA 表達均低于 B 組(P＜0.05)，E 組 AQP-4、MMP-2 mRNA表達低于C組和D組(P＜0.05)；D組AQP-4 mRNA表達低于C組(P＜0.05)。見表6。

2.7 AQP-4、MMP-2蛋白表達

術后3 d，B組AQP-4、MMP-2蛋白表達高于A組(P＜0.05)，C組、D組和E組AQP-4、MMP-2蛋白表達均低于B組(P＜0.05)，D組和E組均低于C組(P＜0.05)，E組低于D組(P＜0.05)。見表7、圖2。

表2 各組脊髓損傷后各時間點BBB評分

表3 各組脊髓損傷后各時間點斜板實驗結果(°)

圖1 大鼠脊髓損傷后3 d脊髓組織(HE染色，400×，bar=50 μm)

表4 各組脊髓損傷后3 d脊髓組織含水量(%)

表6 各組脊髓損傷后3 dAQP-4、MMP-2 mRNA表達

表5 各組脊髓損傷后3 d脊髓組織EB含量(μg/g)

表7 各組脊髓損傷后3 dAQP-4、MMP-2蛋白表達(灰度值比值）

圖2 各組脊髓損傷后3 d脊髓組織AQP-4、MMP-2蛋白表達

3 討論

原發性脊髓損傷后出現繼發性脊髓病理變化，將使原發性脊髓損傷后殘存的神經細胞繼續受到損害，這是脊髓損傷后肢體功能恢復困難的重要原因。減輕/抑制脊髓損傷后的繼發性脊髓損傷，保護原發性損傷后殘存的神經細胞，對脊髓損傷后肢體功能恢復具有重要意義。脊髓損傷后局部內環境平衡被打破，BSCB遭到破壞，在一系列的血管通透性相關因子、細胞毒性因子以及炎癥因子的介導下，出現局部水腫和炎癥反應[14]，而急性脊髓損傷后脊髓水腫和炎癥將加重神經元缺血、缺氧，甚至引起神經元死亡。研究證實[15-16]，急性脊髓損傷后抗水腫、抗炎治療，能保護原發性損傷后殘存的神經細胞，有利于脊髓損傷后肢體功能恢復。大黃素具有抗炎、抗水腫和改善微循環等藥理作用[3-4]。本實驗針對大黃素治療脊髓損傷進行相關研究。

脊髓損傷的實驗動物模型較多，其中脊髓打擊傷的動物模型能較好地復制臨床脊髓損傷病理變化[17]，本實驗選擇Allen法制作脊髓打擊傷模型。通過查閱文獻確認，大黃素選擇20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg作為治療劑量[3,7]，給藥方式是腹膜內注射給藥，這是由于術后10 min給藥時，實驗大鼠仍然處于麻醉狀態，不便口服給藥。主要選擇在脊髓損傷后水腫的高峰期，術后3 d檢測脊髓水腫主要指標[18-19]。

BBB評分和斜板實驗是目前常用的神經功能評定法。BBB評分[20]包括后肢功能恢復過程中幾乎所有的行為學變化，斜板實驗[21]簡單易操作，皆用于評價大鼠脊髓損傷程度和其后肢的運動功能恢復情況。本實驗BBB評分及斜板實驗結果顯示，大黃素高濃度組效果較好。HE結果顯示，脊髓損傷后，神經細胞腫脹、破壞，大量炎性細胞浸潤，組織間隙增寬，水腫嚴重，經大黃素治療后，上述病理變化顯著減輕，與BBB評分及斜板實驗評分基本吻合。

AQP-4在腦和脊髓中廣泛分布，是在脊髓星形膠質細胞膜上高表達的水通道蛋白，控制中樞神經系統水分的進入和排出，具有雙向水通道調節的作用[22]。研究發現[23]，脊髓損傷后AQP-4大量表達可導致急性脊髓水腫，而抑制AQP-4蛋白表達可減輕細胞水中毒和脊髓水腫指數。本實驗結果顯示，大黃素中、高濃度組脊髓組織含水量與模型組比較降低。AQP-4 mRNA和蛋白表達結果顯示，各治療組較模型組表達降低，且具有劑量依賴關系。這也與BBB評分、HE染色以及脊髓組織含水量趨勢基本吻合，推測大黃素通過抑制急性脊髓損傷后AQP-4表達，減輕繼發性脊髓水腫程度，促進大鼠運動功能恢復。

MMP-2是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族成員，MMPs是一組鋅依賴肽鏈內切酶家族，能降解幾乎所有的細胞外基質蛋白，改變細胞外微環境，促進細胞遷徙[24-25]。研究顯示[26]，MMP-2參與人類繼發性脊髓損傷過程，MMP-2高表達可導致蛋白質破裂，中性白細胞、巨噬細胞浸潤，微血管通透性和BSCB通透性增加，血管源性脊髓水腫形成而進一步加重脊髓損傷。本實驗結果顯示，脊髓損傷后3 d，MMP-2 mRNA和蛋白表達增高，大黃素治療后降低。

EB在生理情況下不能透過BSCB，在BSCB被破壞后才可滲漏到脊髓組織中。本實驗通過EB染色檢測BSCB通透性，結果顯示，大鼠脊髓損傷后EB含量增加，大黃素治療后EB含量降低。因此我們認為，急性脊髓損傷后應用大黃素治療能下調MMP-2 mRNA和蛋白表達，降低BSCB通透性，減輕脊髓水腫程度，達到對損傷脊髓的保護作用，這也與HE染色以及AQP-4的表達基本吻合。

綜上所述，大鼠急性脊髓損傷后應用大黃素治療，通過下調AQP-4和MMP-2表達，減輕炎癥反應，保護BSCB，減輕急性脊髓損傷后水腫程度，這有利于保護脊髓損傷后殘存神經元，促進后期肢體功能康復。除能減輕急性脊髓損傷后的繼發性脊髓水腫外，大黃素對脊髓損傷后脊髓具體保護機制，還需繼續研究。

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