糙皮側(cè)耳液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的條件優(yōu)化

王萌萌，黃 亮，張 怡，班立桐

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus），俗稱平菇，屬傘菌目、擔(dān)子菌亞門、側(cè)耳屬，肉質(zhì)肥厚、口感佳，適應(yīng)性強，分布范圍廣，是我國產(chǎn)量第一的食用菌品種[1]。平菇富含營養(yǎng)和藥用成份，在醫(yī)療保健上應(yīng)用范圍很廣[2]。研究發(fā)現(xiàn)平菇具有很強的纖維素、木質(zhì)素降解能力，生物學(xué)效率高[3]。利用食用菌降解秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物既經(jīng)濟又環(huán)保，近年來受到越來越廣泛的重視。

玉米秸稈中富含纖維素、半纖維素和一定數(shù)量的木質(zhì)素，是一種可以資源化利用的固體有機廢棄物[4]。半纖維素大約占植物干重的1/3左右，它與纖維素嚴(yán)密連接構(gòu)成了細(xì)胞壁的主體結(jié)構(gòu)，是自然界中除纖維素外含量最豐富的非淀粉類多糖[5-6]。木聚糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多聚五碳糖，是半纖維素的重要組成成分；木聚糖酶（Xylanase）是指將木聚糖降解成低聚糖和木糖的水解酶，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶[7]。由于木聚糖酶具有多樣性和催化特性，使得該酶近年來在飼料、食品、造紙、紡織、能源等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，也因此越來越受到科研工作者的關(guān)注。本文探討利用農(nóng)業(yè)廢棄物中的玉米秸稈作為主要原料，以平菇進行液體發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，并對其液體發(fā)酵條件進行了初步的研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 供試菌種為糙皮側(cè)耳復(fù)壯109，由天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院食用菌研發(fā)中心提供。

1.1.2 玉米秸稈粉制備 秸稈原料采自靜海良種場試驗地。在烘箱內(nèi)105 ℃下殺青2 h后，將烘箱溫度調(diào)至80 ℃烘48 h至恒重，待自然冷卻，用粉碎機磨碎成粉備用。

1.1.3 培養(yǎng)基 母種（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO42g、MgSO41 g、蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

液體搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、玉米漿2 g·L-1、MgSO41 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、K2HPO40.5 g·L-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 斜面菌種活化 用無菌的接種針，將供試糙皮側(cè)耳菌株從保存的斜面上挑出，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基平板上活化，25 ℃下培養(yǎng)7 d后，再轉(zhuǎn)接到新的平板上，同樣條件下培養(yǎng)后，用無菌打孔器在已長滿菌絲的平板上制出直徑為8 mm、厚約為2 mm的菌塊，備用。

1.2.2 液體搖瓶種子生長曲線的確定 在每個250 mL三角燒瓶中裝入種子液100 mL，在121 ℃的條件下高壓滅菌20 min，滅菌后在冷卻至30 ℃以下，每瓶接入上述糙皮側(cè)耳菌塊3～4塊，25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置1 d后轉(zhuǎn)置轉(zhuǎn)速為150 r·min-1，溫度為25 ℃的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)。每天定時取樣測干重，4次重復(fù)。

1.2.3 液體搖瓶發(fā)酵液的培養(yǎng)時間的確定 接種時取第7天的種子液按每瓶8%的比例吸取，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個250 mL三角燒瓶中裝入100 mL液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速150 r·min-1，每天定時取樣，4次重復(fù)，用酶標(biāo)儀測定木聚糖酶活力。

1.2.4 不同發(fā)酵條件對產(chǎn)酶影響的試驗設(shè)計

（1）不同秸稈添加量對糙皮側(cè)耳液體發(fā)酵液酶活力的影響。秸稈添加量設(shè)定為0 g·L-1、2 g·L-1，4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1。

（2）不同裝液量對糙皮側(cè)耳液體發(fā)酵液酶活力的影響。在250 mL的三角瓶中分別裝入60 mL，80 mL，100 mL和120 mL發(fā)酵液。

（3）不同pH值對糙皮側(cè)耳液體發(fā)酵液酶活力的影響。pH值分別設(shè)定為4，5，6，7，8，9。

（4）不同轉(zhuǎn)速對糙皮側(cè)耳液體發(fā)酵液酶活力的影響。轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r·min-1、180 r·min-1、210 r·min-1。

1.2.5 木聚糖酶活力的測定方法

（1）粗酶液的制備。取10 mL培養(yǎng)好的液體發(fā)酵液于離心管中，4 ℃下，4 000 r·min-1離心20 min，上清液即為粗酶液。

（2）酶活力的測定。取0.1 mL上清液于25 mL具塞試管中，加入0.9 mL木聚糖溶液（pH值5.0的50 mmol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制），40 ℃水浴保溫30 min，取出后立即加入3 mL DNS試劑，煮沸10 min。流水冷卻至室溫后加入蒸餾水定容至25 mL，混勻后用酶標(biāo)儀測540 nm處吸光值的變化，以煮沸滅活10 min的粗酶液作對照。酶活力單位定義為：每分鐘催化木聚糖水解生成1 μmol木聚糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

（3）酶活力的計算公式

酶活力：[W(mg·mL-1)×Df×1 000]／[M×30 min]

Df：表示稀釋度V1（定容后的總體積25 mL）/V2（粗酶液的體積0.1 mL）

W（mg·mL-1）：酶解反應(yīng)產(chǎn)生的木糖量，由標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0142+5.6682X得到

1 000：將mmol轉(zhuǎn)換成μmol所乘的系數(shù)M：表示木糖的分子量，為150.13 mg·mmol-1

1.2.6 菌絲干重

（1）取10 mL液體發(fā)酵液于離心管中，4 ℃條件下，4 000 r·min-1離心20 min，去掉上清液并用蒸餾水洗滌，靜置沉淀后再次離心，去掉上清液，放入80 ℃烘干箱進行烘干至恒重。（一般用于測定發(fā)酵液，種子液的生長曲線。

（2）取80目篩網(wǎng)，將整瓶菌液倒向其表面，過濾得菌絲球，用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲球上殘留的培養(yǎng)基直至沖洗干凈，將菌球轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，放入設(shè)有80 ℃的烘干箱烘干到質(zhì)量不發(fā)生變化，用電子天平稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 糙皮側(cè)耳搖瓶種子液的生長曲線

根據(jù)糙皮側(cè)耳種子液的生長曲線選擇最適的接種發(fā)酵液的時間，從圖1可以看出，隨著時間的增長，糙皮側(cè)耳液體種子液的菌絲呈干重先上升后降低趨勢，第七天菌絲干重達(dá)到峰值16.33 g·L-1后逐漸降低。

圖1 糙皮側(cè)耳種子液的生長曲線

2.2 糙皮側(cè)耳搖瓶發(fā)酵液的生長曲線

根據(jù)液體搖瓶發(fā)酵液的生長曲線，了解菌絲的生長規(guī)律以及達(dá)到酶活力峰值的時間，進而確定液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的終點。由圖2可知，0～4 d糙皮側(cè)耳液體菌種酶活力值沒有太大的變化，4～5 d時快速增加，液體菌種培養(yǎng)到第五天時此菌種的酶活力值達(dá)到峰值49.23 U·L-1，此后菌體的酶活力值減小，因此，確定糙皮側(cè)耳復(fù)壯109液體搖瓶的發(fā)酵終點為第五天。

圖2 液體搖瓶發(fā)酵液的酶活變化曲線

2.3 不同秸稈添加量對糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

以農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈粉作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)糙皮側(cè)耳產(chǎn)酶[8]，玉米秸稈添加量分別為0 g·L-1，2 g·L-1，4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1，進行產(chǎn)酶試驗，結(jié)果如圖3所示。

圖3 秸稈對糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

由圖3可知，隨著玉米秸稈含量的增加，木聚糖酶活力先增大后減小，秸稈含量為0～4 g·L-1時，木聚糖酶活力隨秸稈含量的增大而升高，在4 g·L-1時，酶活力達(dá)到峰值52.29 U·L-1，隨后隨著秸稈含量的增大酶活力逐漸減小，當(dāng)秸稈含量為10 g·L-1時，酶活力最低，這可能是由于加入的秸稈含量過大，導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧減少，從而影響糙皮側(cè)耳的生長代謝。圖3結(jié)果表明，加入一定量的玉米秸稈可以促進糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶，在玉米秸稈添加量為4 g·L-1時，木聚糖酶活力最高，所以酶活力以玉米秸稈添加量為4 g·L-1最佳。

2.4 不同裝液量對糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

分別向250 mL的三角燒瓶中裝入60 mL，80 mL，100 mL和120 mL發(fā)酵液，然后每瓶以8%的接種量接種，秸稈4 g·L-1，在溫度為25 ℃，150 r·min-1的搖床中培養(yǎng)5 d后，取樣測酶活力。

裝料量對糙皮側(cè)耳產(chǎn)酶的影響主要表現(xiàn)在兩方面，一是裝料量過多，引起錐形瓶內(nèi)通風(fēng)不暢，供氧不足，微生物生長不好而影響產(chǎn)酶；二是裝料量過少，引起錐形瓶內(nèi)基質(zhì)表面水分蒸發(fā)過快，影響微生物的生長和代謝，產(chǎn)酶量仍然不高[9]。由圖4可看出當(dāng)裝液量為60～100 mL時，酶活力值逐漸的在增大，在60～80 mL時增幅最大，當(dāng)裝液量為100 mL時，產(chǎn)木聚糖酶活力最高，酶活力值達(dá)到峰值56.01 U·L-1，所以選擇裝料量100 mL為宜。

圖4 裝液量對糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

2.5 不同pH值對糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

pH值對調(diào)節(jié)菌絲細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡和分解發(fā)酵液的營養(yǎng)物質(zhì)具有一定作用。配制發(fā)酵液pH值分別為4，5，6，7，8，9，以研究不同的初始 pH 值對木聚糖酶活力的影響，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著pH值的增加木聚糖酶活力在不斷增大，當(dāng)pH值為8時，酶活力值達(dá)峰值67.32 U·L-1，pH值達(dá)到9后酶活力有所下降，因此確定最佳pH值為8。

圖5 pH值對糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

2.6 不同轉(zhuǎn)速對糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

溶氧量的大小主要取決于轉(zhuǎn)速的快慢，資料表明轉(zhuǎn)速越大，溶氧越大，但太大的轉(zhuǎn)速會產(chǎn)生較大的剪切力，反而抑制菌絲生長[10]。在前面的基礎(chǔ)上，設(shè)置轉(zhuǎn)速分別為150 r·min-1、180 r·min-1，210 r·min-1，結(jié)果見圖 6。

由圖6可以看出，不同的轉(zhuǎn)速會導(dǎo)致酶活力值大小產(chǎn)生顯著差異，當(dāng)轉(zhuǎn)速在180 r·min-1時，酶活力值達(dá)到峰值76.11 U·L-1，當(dāng)超過180 r·min-1時，酶活力值減小，甚至降到最低，因此選用180 r·min-1為最佳轉(zhuǎn)速。

圖6 轉(zhuǎn)速糙皮側(cè)耳產(chǎn)木聚糖酶活力的影響

3 結(jié)論與討論

我國玉米秸稈資源十分豐富，年產(chǎn)量約為3億t[11]。研究表明，大部分玉米秸稈主要以堆積、燒荒等形式直接傾入環(huán)境，造成極大的浪費以及環(huán)境污染[12]。通過本試驗發(fā)現(xiàn)，糙皮側(cè)耳對玉米秸稈具有較強的降解能力，產(chǎn)木聚糖酶的能力也較高，本試驗利用糙皮側(cè)耳降解玉米秸稈，為固體農(nóng)業(yè)廢棄物——玉米秸稈的合理利用提供了依據(jù)，進一步解決了玉米秸稈引起的環(huán)境污染問題。

通過糙皮側(cè)耳種子液生長曲線可確定最佳的接種時間為第7天，發(fā)酵終點為第5天，試驗結(jié)果表明，利用玉米秸稈為主要原料，糙皮側(cè)耳液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最佳發(fā)酵條件為：玉米秸稈含量為4 g·L-1，裝液量為100 mL，pH值為8，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。本試驗利用糙皮側(cè)耳降解玉米秸稈產(chǎn)生木聚糖酶，這對降低木聚糖酶生產(chǎn)成本，進行工業(yè)化擴大生產(chǎn)提供較好的依據(jù)，同時在農(nóng)村環(huán)境工程提升及農(nóng)民增收方面也具有一定的意義。

[1]陳靚.糙皮側(cè)耳種質(zhì)資源評價及優(yōu)良菌株選育的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[2] Carbonero ER, Gracher AHP, Smiderle FR, et al. A glucanfrom the fruit bodies of edible mushrooms Pleurotus eryngiiand Pleurotus ostreatoroseus[J]. Carbohydrate Polymers,2006,66 (2) : 252-257.

[3]化雪艷，李碩，唐克華，等.3種食用菌固態(tài)發(fā)酵降解杜仲半纖維素、纖維素和木質(zhì)素[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（7）：67-71.

[4]鐘華平，岳燕珍.中國作物秸稈資源及其利用[J].資源科學(xué)，2003，25（4）：61-65.

[5]閔兆升，郭會明，顧承真，等.木聚糖酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，18（10）：168-173.

[6] Bruna da Silva Menezes,Daniele Misturini Rossi, Marco Ant?nio Záchia Ayub. Screening of filamentous fungi to produce xylanase and xylooligosaccharides in submerged and solid-state cultivations on rice husk, soybean hull, and spent malt as substrates [J]. World J Microbiol Biotechnol ,2017 .

[7]葉波，周婭琴.木聚糖酶綜述[J].輕工科技，2012，17（7）：14-16.

[8]朱洪龍. 白腐真菌生物降解油菜秸稈及飼料化研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[9]吳萍，周鳴鳴，盛偉.平菇產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（10）：168-172.

[10]傅愷.真菌漆酶高產(chǎn)菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶及酶促降解有機染料的動力學(xué)研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2013.

[11]班春華.玉米秸稈的應(yīng)用現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備，2014（12）：61-62.

[12]宗義，朱萌順，馬龍，等.秸稈就地焚燒對大氣環(huán)境影響及其對策建議[J].科技傳播，2014（6）：113-116.