慢病毒介導的PRL-3 shRNA 對結腸癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響

王燕，張姣，王會峰，王寧菊

結直腸癌是世界范圍內常見的消化道惡性腫瘤之一，中國國家癌癥登記中心調查發現結直腸癌發病率居我國惡性腫瘤的第4位，死亡率居第5位［1］。目前已證實肝再生磷酸酶-3（PRL-3）在結腸癌中高表達［2］，且PRL-3能啟動結腸癌腫瘤細胞的增殖和侵襲［3］，但是確切的分子機制尚需要進一步研究。本課題組前期研究證實靶向PRL-3基因的shRNA慢病毒載體可以明顯抑制結腸癌SW480細胞的PRL-3基因表達水平，后續功能實驗均選擇PRL-3 shRNA進行。本研究利用已構建的慢病毒載體感染SW480細胞，進一步探討PRL-3基因沉默后對人結直腸癌SW480細胞增殖、侵襲和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人結直腸癌SW480為寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心保存，RPMI 1640培養基、胎牛血清（Ausbian公司），TRIzol（上海普飛公司）、MTT試劑（Genview公司）；DMSO（上海試一化學試劑有限公司）；SYBR Master Mixture試劑盒（TaKaRa公司），D-Hanks、PRL-3 shRNA、陰性對照的慢病毒顆粒（上海吉凱基因技術有限公司）；酶標儀（Tecan infinite）；DMEM、侵襲試劑盒及 Transwell試劑盒（Corning公司），胰酶（上?；瘜W試劑公司），細胞凋亡檢測試劑盒 Annexin V-FITC（eBioscience公司），GIEMSA染色液（Sigma公司）。Real time PCR儀（Agilent公司），熒光顯微鏡（奧林巴斯），離心機（賽默飛世爾科技中國有限公司），倒置顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司），CO2培養箱（SANYO），生物安全柜（上海振梓創電氣凈化設備有限公司），流式細胞儀（Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 SW480細胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，37℃恒溫，5%CO2條件下持續培養，所有的實驗要求細胞的生長狀態為對數生長期。

1.2.2 慢病毒PRL-3 shRNA轉染SW480細胞株 SW480細胞接種于12孔板中，4×104個/孔，當每孔細胞密度大約20%時，分別加入慢病毒PRL-3 shRNA、陰性對照的慢病毒顆粒，進行SW480細胞的轉染，16 h更換培養基，72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達效率。實驗分組：空白對照組（細胞不作處理）、陰性對照組（陰性對照病毒組）、轉染組（轉染慢病毒PRL-3 shRNA組）。

1.2.3 Real-time PCR檢測轉染后SW480細胞中PRL-3 mRNA表達 收集各個實驗組對數生長期的細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR檢測細胞內PRL-3 mRNA表達水平，內參為GAPDH。反應條件：95℃預變性 30 s；95℃ 5 s，60℃退火 30 s，45個循環。引物序列：PRL-3上游引物 5′-GATGGCATCACCGTTGTGGA-3′，下 游 引 物 5′-CGTACTTCATCCCGCTCTCAAT-3′，擴 增 片 段 199 bp；GADPH 上游引物 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物 5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增片段121 bp；由上海吉凱基因生物公司合成。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，實驗重復3次。

1.2.4 平板克隆形成實驗 PRL-3 shRNA、陰性對照的慢病毒顆粒轉染SW480細胞后第5天種板，持續培養5 d，每3 d換液1次。按400個細胞/孔分別接種到6孔板中，使細胞分散均勻。分空白對照組、陰性對照組、轉染組，繼續培養1周，直到可見克隆生長時，按照GIEMSA染色法進行染色，鏡檢計數。實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測PRL-3 shRNA轉染對SW480細胞凋亡的影響 PRL-3 shRNA轉染SW480細胞后第3天傳代，第5天檢測，細胞融合度達85%以上，收集各組細胞各1.0×105個，PBS洗3次，上流式細胞儀單染法檢測細胞凋亡率變化。實驗重復3次。

1.2.6 MTT法檢測PRL-3 shRNA對細胞增殖的影響 收集各個實驗組細胞，待每組細胞生長狀態良好后，接種96孔板，密度為1×104個/孔，設重復孔，按照MTT試劑操作方法進行，用酶聯免疫標記分析儀測其光密度（OD）值，連續5 d。重復3次。

1.2.7 Transwell小室法檢測PRL-3 shRNA對SW480細胞遷移能力的影響 收集空白對照組、陰性對照組、轉染組（PRL-3 shRNA轉染SW480細胞后72 h）細胞，調整細胞密度至1.0×105個，棄培養基并加入100μL細胞懸液，下室內加入600μL 30%FBS的培養基。37℃培養箱培養34 h后，用GIEMSA染色液進行染色，鏡檢計數穿膜的細胞數，每個樣本隨機計數5個視野，取平均值，實驗重復3次。

1.2.8 侵襲小室法檢測PRL-3 shRNA對SW480細胞侵襲能力的影響 收集空白對照組、陰性對照組、轉染組（PRL-3 shRNA轉染SW480細胞后72 h）細胞，調整細胞密度至1.0×105個，實驗前將上、下小室各加500μL無血清培養基，使Matrigel基質層再水化。水化后上室加入500μL細胞懸液，下室內750μL 30%胎牛血清培養基，37℃培養箱培養34 h后，用濕棉拭子輕輕移去小室內未轉移細胞，GIEMSA染色，倒置顯微鏡下計數，觀察侵襲Matrigel基質層后的細胞數，實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒PRL-3 shRNA轉染SW480細胞建立穩定轉染細胞系 將PRL-3 shRNA和陰性對照組的慢病毒顆粒轉染至人結腸癌細胞株SW480并培養72 h后，于熒光顯微鏡下觀察轉染效果，可見GFP表達的細胞比例達80%以上，慢病毒PRL-3 shRNA成功轉染SW480細胞并穩定表達，后續實驗可以進行，見圖1。

2.2 PRL-3 shRNA轉染結腸癌SW480細胞后mRNA表達水平 將PRL-3 shRNA和陰性對照的慢病毒顆粒轉染SW480細胞72 h后，細胞生長良好，real-time PCR結果顯示：轉染組PRL-3 mRNA相對表達水平低于空白對照組、陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），轉染組PRL-3基因敲減效率達到89.6%?？瞻讓φ战M和陰性對照組比較差異無統計學意義，見表1。

2.3 平板克隆形成實驗結果 轉染組細胞克隆形成數量較空白對照組、陰性對照組明顯減少（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組比較差異無統計學意義，見表1。

Fig.1 The expression of green fluorescent protein in SW480 cells infected with lentivirus PRL-3 shRNA圖1 慢病毒PRL-3 shRNA感染SW480細胞后GFP的表達（×100）

Tab.1 Changes of relative expression of PRL-3 mRNA,colony formation and the apoptosis rate of SW480 cells after transfection表1 轉染后SW480細胞PRL-3 mRNA、克隆形成、凋亡的變化 （n=3，±s）

Tab.1 Changes of relative expression of PRL-3 mRNA,colony formation and the apoptosis rate of SW480 cells after transfection表1 轉染后SW480細胞PRL-3 mRNA、克隆形成、凋亡的變化 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組轉染組F PRL-3 mRNA 0.864±0.124 1.001±0.044 0.105±0.014ab 120.342＊＊克隆形成（個）123.000±7.211 119.670±5.508 38.330±3.512ab 218.577＊＊凋亡率（%）4.811±0.290 4.816±0.317 8.600±0.174ab 25.841＊＊

Tab.2 The MTT result of proliferation of SW480 cells after transfected PRL-3-shRNA表2MTT法檢測轉染PRL-3-shRNA后SW480細胞增殖能力的影響 （n=3，OD值，±s）

Tab.2 The MTT result of proliferation of SW480 cells after transfected PRL-3-shRNA表2MTT法檢測轉染PRL-3-shRNA后SW480細胞增殖能力的影響 （n=3，OD值，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組轉染組F 24 h 0.157±0.004 0.149±0.003 0.153±0.002 4.483 48 h 0.388±0.025 0.369±0.006 0.353±0.005 3.985 72 h 0.737±0.012 0.638±0.027 0.378±0.011ab 40.597＊＊96 h 1.197±0.021 0.948±0.044 0.471±0.001ab 525.360＊＊120 h 1.865±0.039 1.492±0.019 0.671±0.029ab 1 260.359＊＊

2.4 PRL-3 shRNA轉染后SW480細胞凋亡率的變化 轉染組細胞凋亡率與空白對照組、陰性對照組比較均顯著增高（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組比較差異無統計學意義，見表1。

2.5 轉染PRL-3 shRNA后SW480細胞增殖能力的變化 轉染組感染24、48 h后與空白對照組及陰性對照組比較，細胞增殖能力差異無統計學意義，轉染72 h后，轉染組與空白對照組及陰性對照組比較，細胞增殖能力明顯受到抑制（P＜0.05），轉染120 h抑制更為顯著，見表2。

2.6 轉染PRL-3-shRNA后SW480細胞遷移和侵襲力變化 轉染組細胞遷移和侵襲力較空白對照組、陰性對照組比較均顯著下降（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組遷移和侵襲力相比差異無統計學意義，見圖2、表3。

3 討論

PRLs是近年來發現的癌基因家族。PRLs家族成員包括 PRL-1、2、3，PRL-1、2 能使細胞向腫瘤細胞方向轉化。PRL-3參與多種腫瘤的發生與發展，在結直腸癌［2］、非小細胞肺癌［4］、卵巢癌［5］、前列腺癌［6］和乳腺癌［7］中表達上調，在腫瘤細胞的增殖、黏附、遷徙及轉移中發揮了重要的正向調控作用。抑制PRL-3的表達會減弱三陰性乳腺癌細胞遷移及侵襲能力［7］。劉楠等［8］發現下調高轉移潛能的肺癌A549細胞中PRL-3的表達水平后，A549細胞的遷移、侵襲能力明顯降低，但增殖能力沒有明顯變化，提示PRL-3在肺癌中發揮的作用可能與在其他類型的腫瘤不同。PRL-3在腫瘤增殖、侵襲和轉移的多個環節中發揮重要作用，而對結腸癌細胞是否有影響需要進一步研究。

Fig.2 Migration and invasion of SW480 cells after transfection detected by Transwell assay and invasion assay(×100)圖2 Transwell小室和侵襲小室法檢測轉染后SW480細胞遷移和侵襲力變化（×100）

Tab.3 Changes of migration and invasion of SW480 cells after transfection表3 轉染后SW480細胞遷移及侵襲力的變化（n=3，個，±s）

Tab.3 Changes of migration and invasion of SW480 cells after transfection表3 轉染后SW480細胞遷移及侵襲力的變化（n=3，個，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對照組比較，b與陰性對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組轉染組F細胞遷移116.670±3.215 112.000±1.732 73.670±5.508ab 114.740＊＊細胞侵襲65.000±3.000 66.330±0.577 38.670±6.110ab 46.950＊＊

慢病毒載體廣泛應用于穩定的轉基因過表達、制備不同種類的轉基因動物、持續的基因沉默等方面，具有不良反應低、轉染效率高的優勢。本研究利用已構建的慢病毒載體轉染結腸癌SW480細胞，real-time PCR結果顯示該慢病毒載體對SW480細胞中PRL-3基因的敲減效率達到89.6%，該重組慢病毒載體能夠有效地抑制SW480細胞中PRL-3基因的表達，建立穩定轉染的細胞株，這也證實了慢病毒介導的基因沉默技術轉染效率高，是基因治療的重要工具。本研究顯示下調PRL-3的表達水平使SW480細胞存活率明顯受到抑制，說明通過沉默PRL-3基因表達，可以抑制結腸癌SW480細胞的增殖。本研究轉染組細胞凋亡率明顯高于空白對照組及陰性對照組，與卵巢癌［5］、前列腺癌［6］中 PRL-3 的研究結果一致：PRL-3促進卵巢癌、前列腺癌細胞的生長和遷移，沉默PRL-3抑制腫瘤細胞的生長。

浸潤和轉移是惡性腫瘤最重要的特征?，F有的研究顯示PRL-3促進腫瘤細胞侵襲轉移的機制主要有以下幾個方面：（1）PRL-3可能通過改變RhoA、RhoC活性及其下游因子影響肺癌細胞的遷移和侵襲［4，8］。（2）上皮間質轉化（EMT）是腫瘤浸潤和轉移的關鍵步驟。PRL-3可能通過EMT途徑影響結腸癌細胞的侵襲。Lai等［3］發現PRL-3誘導KCNN4表達，導致EMT和E-鈣黏蛋白下調，促進腫瘤轉移。（3）張建龍等［9］發現 PRL-3 通過上調miRNA-21抑制PTEN表達，調節PI3K通路，從而促進結腸癌細胞的遠處轉移。（4）Gari等［7］用特異性抑制劑AMPI-109降低PRL-3表達水平后，三陰性乳腺癌細胞的侵襲遷移能力明顯降低；PRL-3過表達通過上調基質金屬蛋白酶（MMP）-10促進三陰性乳腺癌細胞的侵襲。以上研究顯示PRL-3參與多水平調控及信號通路，在腫瘤發生、發展中有重要作用，PRL-3在肺癌、乳腺癌和結腸癌等腫瘤中的作用機制不同，可能與腫瘤的異質性有關。本研究結果顯示：與空白對照組及陰性對照組相比，轉染組穿越Matrigel膠的細胞數明顯減少，提示下調PRL-3后，可以減弱結腸癌細胞的侵襲轉移能力。

本研究表明，PRL-3在調控結腸癌增殖、侵襲、凋亡過程中起著重要作用，PRL-3可能作為結腸癌患者早期診斷、治療選擇的分子標志物。本課題不足之處在于未對PRL-3調控結腸癌致病機制進行深入研究。后續研究重點將關注PRL-3可能通過影響哪些下游靶基因的表達影響結腸癌侵襲、轉移及其可能的分子機制，以期為結腸癌的靶向治療提供更多依據。

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