基于枯草芽孢桿菌重組菌株構建技術制備海洋源金屬硫蛋白

，，，

(1.廈門海洋職業技術學院，福建 廈門 361100；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；3.國家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術研究中心，福建 廈門 361005；4.廈門大學，福建 廈門 361005；5.東山出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心，福建 東山 363400)

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類普遍存在于生物體內的、高度可誘導性的內源金屬結合蛋白，具有維持生物體內必須金屬含量動態平衡、重金屬解毒、清除自由基，改善機體免疫力、增強機體抗應激能力等多種作用[1-3]，且與動物機體的生長發育及部分疾病的發病機理有著密切的關系。因此，MT在醫學、化妝品、保健食品添加劑、環保等方面得到了廣泛應用。

目前，國內市場上常見的MT多數是從兔肝臟中提純[4]，提取工藝中使用大量有機溶劑[5-7]，且步驟繁復，產量極低，致使MT的價格極其昂貴，從而使其應用和研究受到限制。采用基因重組技術規?；a制備金屬硫蛋白，對其大規模開發和作用機理的研究有重要意義。目前利用大腸桿菌作為工業生產蛋白質的優選宿主細胞研究MT表達方法多有文獻報道[8-9]，但其缺少蛋白翻譯后進行加工和修飾的功能，且目的蛋白極易形成包涵體，分離純化繁瑣，給生產實踐帶來困難。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種傳統的酶制劑工業生產菌株，具有可操作性強、發酵周期短的優點，可直接將表達產物分泌到培養基中，也是分泌表達外源基因的良好受體菌[10-11]。同時枯草芽孢桿菌不分泌內毒素，具有較好的生物安全性，是美國FDA和我國農業部批準使用的食品安全菌種，其發酵產物可直接用于食品生產中。近年來枯草芽孢桿菌作為外源基因表達的宿主系統發展迅速并展現出良好的工業應用前景[12-16]。

濾食性的底棲雙殼類海洋動物對重金屬有較強的生物累積能力，海洋貝類MT對重金屬具有高敏感的應激效應[17-22]，且相對于陸地源MT，海洋源MT具有獨特的化學結構和特殊的生物活性。本研究旨在解決制約MT產業發展原料來源瓶頸，應用基因重組技術，將褶牡蠣(Ostreaplicatula)金屬硫蛋白基因全長序列Op-MT，插入到表達載體pHT43-SUMO的相應位點，并轉入八種蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌WB800N，擬構建安全高效分泌表達的重組枯草芽孢桿菌MT基因工程菌。以期能獲得具高安全性、高產量和高活性的高純目標蛋白，使海洋源MT具有極大地應用于實際工業生產潛能，為天然高效重金屬生物解毒劑的成功開發和推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和培養基

枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800N為廈門大學某博士惠贈，E.coliDH-5α購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒載體pMD19-Tvector購自寶生物工程(大連)有限公司，枯草芽孢桿菌表達載體pHT43為本實驗室保藏。E.coliDH-5α和枯草芽孢桿菌生長和發酵培養基為LB培養基。

1.1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、PCR反應試劑、限制性內切酶SacII/BamHI/SmaI、T4 DNA連接酶、質粒提取和膠回收試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，胰蛋白胨、酵母浸提粉(英國OXOID 公司產品)購自廈門綠茵公司，氨芐青霉素、氯霉素、新霉素為Solarbo公司產品。PCR引物及DNA測序均由上海生物工程技術有限公司完成。氯化鎘(CdCl2)購自廈門綠茵試劑有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 褶牡蠣金屬硫蛋白基因的克隆以及分泌表達載體的構建

運用TRIzol試劑盒提取褶牡蠣內臟團總RNA，采用TaKaRa Prime-Script TM RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，Japan)進行反轉錄。根據GeneBank褶牡蠣金屬硫蛋白基因序列Op-MT(登錄號：KP875559)設計引物(表1，F1/R1)，PCR擴增Op-MT基因序列。PCR產物經過回收、連接至克隆載體pMD-19，并轉化到E.coliDH-5α中，送至上海生物工程技術進行序列測定。用BamHI/SmaI酶切質粒pMD-19-Op-MT和pHT43-SUMO表達載體，各自膠回收后用T4 DNA連接酶并轉化到E.coliDH-5α細胞，在含有100 μg/mL氨芐青霉素(Amp)LB平板上篩選陽性轉化子并加以驗證。

1.2.2 重組工程菌構建和篩選

以枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800N為表達宿主，用電轉法轉化分泌表達載體pHT43-SUMO，在含有10 μg/mL氯霉素和50 μg/mL新霉素的LB平板上篩選。得到陽性轉化子菌株，命名為B.subtilisWB800N/pHT43-SUMO-Op-MT(圖1)。

將B.subtilisWB800N/pHT43-SUMO-Op-MT接種到LB液體培養基(10 μg/mL氯霉素和50 μg/mL新霉素)中，37℃培養過夜，收集菌液并提取總DNA，以F2/R2(表1)為引物進行PCR鑒定。

表1 褶牡蠣金屬硫蛋白cDNA克隆測序及PCR中所用引物

1.2.3 融合蛋白誘導表達和分離純化

100 mL WB800N/pHT43-SUMO-Op-MT菌液擴大誘導培養，培養條件：37℃，4 h，1 mmol/L IPTG，220 r/min振蕩培養至OD600為0.8～1.0。2、4 h分別離心收集發酵液上清，進行SDS-PAGE凝膠電泳定性，分離膠12%，濃縮膠5%。另一組空白B.subtilisWB800N作為對照。電泳結束后凝膠染色4～6 h，將脫色后的凝膠保存于去離子水中，用Bio-Rad凝膠成像系統拍照。

對發酵液進行His-tag標簽親和純化。首先，用3個柱體積的TBS(pH 8.0)緩沖液平衡鎳柱。然后，將上清液上樣，流速約為1 mL/min。上樣完畢后，再用3個柱體積的TBS(含50 mmol/L 咪唑，pH 8.0)進行洗滌；隨后，用洗脫緩沖液(含300 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白，收集各個洗脫峰進行12%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測。最后利用Bradford method定量目的蛋白。

1.2.4 融合蛋白的 Western blotting鑒定

將重組工程菌誘導表達48 h后的發酵液和空白對照組(B.subtilisWB800N)的發酵液，經丙酮沉淀后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜(濕轉：300 mA，1 h)，用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入用 TBST(Tris 緩沖鹽-吐溫溶液，含10 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.05% 土溫-20)1∶10 000 稀釋的 His 一抗，37℃ 孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次15 min ；加入用 TBST 1∶20 000 稀釋的His 二抗，37℃ 孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次15 min；HRP-DAB 底物顯色試劑盒顯色，用 Bio-Rad 凝膠成像系統拍照。

1.2.5 褶牡蠣金屬硫蛋白HPLC檢測

將取出的菌液7 000 r/min 10min收集菌液，于80℃下水浴5 min，12 000 rpm/min 離心10 min，后取上清。

MT含量測定：取MT上清液20 μL，依次加入20%(W/V)TCEP溶液3 μL、5 mg/mL的SBD-F溶液10 μL及反應緩沖液(1 mol/L硼酸、30 mmol/L EDTA、0.8 mol/L KOH，pH 10.5)75 μL，震蕩混勻，于50℃下水浴反應30 min，反應完成后加入HCl(4 mol/L)10 μL終止反應，然后用20 mmol/L定容緩沖液(pH 7.5)定容至1 mL，旋渦震蕩混勻，過0.22 μm水系膜后上HPLC進行MT含量測定。采用HPLC方法測定其中-SH含量以進行MT間接定量[23]。

色譜條件：流動相為乙腈∶磷酸緩沖液(25 mmol/L，pH=7.5)∶甲醇=18∶80∶2，色譜柱：ODS-BP(填料：Sinochrom，4.6 mm×250 mm，5 μm)C18柱；進樣量：40 μL；洗脫時間：20 min；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；激發波長380 nm，發射波長510 nm。圖6(A)為色譜條件下得到的兔肝MT標樣色譜圖，MT保留時間為7.3～7.7 min。

1.2.6 融合蛋白活性檢測

配置50、100、200、500、700 μmol/L的CdCl2工作液各100 μl，分別將其涂布于LB固體培養基平板上，待其完全吸收后，取100 μL OD600為4.0的枯草芽孢桿菌重組Op-MT工程菌均勻涂布于上述平板上，同時以枯草芽孢桿菌WB800N菌株為對照組，37℃倒置培養12～16 h觀察菌落生長情況。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增Op-MT及分泌表達載體的構建

以褶牡蠣內臟團總RNA反轉錄得到的DNA為模板，PCR擴增得到目的基因Op-MT與預計大小相符(約為324 bp)，見圖2。用BamHI/SmaI分別雙酶切此PCR產物和分泌表達載體pHT43后用連接酶連接，構建重組質粒pHT43-SUMO-Op-MT。該質粒的酶切驗證見圖2。酶切片段大小約為660 bp，與預期相符，此片段為目的基因SUMO-Op-MT。

注：左為PCR擴增SUMO-Op-MT基因；M：DNA Marker；1：SUMO-Op-MT擴增產物。右為SUMO-Op-MT表達載體的酶切圖；M：DNA Marker；2：表達質粒雙酶切。

Notes：Amplification of SUMO-Op-MT gene by PCR(left)；M：DNA Marker；1：Gene of SUMO-Op-MT.Restrictive enzyme digestion of SUMO-Op-MT(right)；M：DNA Marker；2：Restrictive enzyme digestion of SUMO-Op-MT.

2.2 高效分泌表達 Op-MT 重組工程菌篩選

將重組質粒 pHT43-SUMO-Op-MT 運用化學轉化法轉化宿主枯草芽孢桿菌B.subtilisWB800N，經過氯霉素和新霉素抗性篩選、PCR鑒定，得到一株高效表達Op-MT的枯草桿菌工程菌B.subtilisWB800N/pHT43-SUMO-Op-MT，見圖3。

注：A：陰性對照；B：枯草芽孢桿菌WB800N對照；C：重組WB800N-MT枯草芽孢桿菌工程菌；D：枯草芽孢桿菌WB800N對照。

Notes：A：Negative control;B：Control of WB800N bacteria;C：Recombinant bacteria of WB800N-MT;D：Control of WB800N bacteria.

2.3 重組蛋白的誘導表達、分離純化和Western blotting 鑒定

100 mL WB800N/ pHT43-SUMO-Op-MT菌液擴大誘導培養，培養條件：37℃，4 h，1 mmol/L IPTG。2、4 h分別離心(12 000 r/min，4℃，30 min)收集發酵液上清，進行SDS-PAGE 電泳分析。以未轉入表達載體的枯草芽孢桿菌培養液為空白對照(圖 4)。分析圖4發現在 23 kD(其中Op-MT編碼蛋白大小為10.5 kD)位置出現了一條明顯的特異性條帶，且融合蛋白為可溶形式表達。

利用 His-tag 標簽親和純化 SUMO-Op-MT 融合蛋白，并用含 500 mmol/L 咪唑、pH 8.0 TBS 洗脫液進行洗脫。收集洗脫峰并進行12% SDS-PAGE 凝膠電泳分析。結果顯示，洗脫液中含有分子量約為 23 kD 的目的條帶(圖 4)。Bradford method 分析結果表明，蛋白純度在 95% 以上(圖 4)(目的蛋白得率0.436 mg/mL)。然后將純化后的目的蛋白進行 Western blotting 鑒定，結果顯示融合蛋白能與 His-Tag 單克隆抗體產生陽性反應(圖 5)，且與SDS-PAGE 中 SUMO-Op-MT 融合蛋白的位置相符，說明融合蛋白在宿主菌中得到了表達。

注：M：虹彩蛋白 Marker；?：未轉化(陰性對照)；紅色箭頭為目的蛋白。

Notes：M：Protein Marker;?：Non-transfector(negative control);Red arrowhead：Target protein.

2.4 重組枯草芽孢桿菌發酵液中Op-MT的HPLC檢測

以兔肝MT為標樣，兔肝MT標品(0.1 mg/mL)和枯草芽孢桿菌重組工程菌發酵液HPLC結果見圖6。兔肝MT目的峰的保留時間為7.3～7.7 min。結果顯示，枯草芽孢桿菌重組工程菌發酵液在7.7 min有峰出現，說明枯草芽孢桿菌重組工程菌發酵液中含有目的蛋白，枯草芽孢桿菌重組工程菌成功表達了目的蛋白Op-MT，表達量為0.13 mg/mL。

注：M：蛋白 Marker；+.陽性對照。

Notes：M：Protein Marker;+：Positive control.

2.5 褶牡蠣金屬硫蛋白的活性檢測

將含有SUMO-Op-MT質粒的重組枯草芽孢桿菌工程菌和不含SUMO-Op-MT質粒的空載體枯草芽孢桿菌空載體分別涂布于含有CdCl2的培養基上，37℃培養12～16 h后發現(圖7)，在濃度為50 μmol/L的CdCl2平板上，空載體的菌落少于含有MT的重組工程菌；當CdCl2濃度達到100 μmol/L時，MT重組工程菌生長較差，而空載體平板上未能檢測到菌落；說明含有SUMO-Op-MT的重組枯草芽孢桿菌工程菌對重金屬鎘耐受能力增強。但是當CdCl2濃度達到200 μmol/L及以上時，兩種菌落都未能被檢測到，說明在高濃度CdCl2脅迫下金屬硫蛋白活性受到了抑制。

3 討論

目前，國內對MT的基因工程方面研究大多集中在大腸桿菌表達系統和微生物MT解毒，對MT工業化應用關注較少，具有工業化生產價值的基因工程菌株報道更是極少。近年來，國內外學者針對MT大腸桿菌表達系統研究做了大量工作，取得了較大進展，但E.coli直接表達MT，其表達量極低，通常需使用同位素標記才能檢測到[24-26]，或因形成大量無生物活性的包涵體，而復性效果不明顯[27-30]。本課題組前期研究也證實盡管大腸桿菌(E.coli)直接表達MT也能高效表達，但是表達的蛋白仍以包涵體的形式存在。

枯草芽孢桿菌作為宿主菌，具有表達和分泌活性蛋白、直接將表達產物分泌到培養基中、不分泌內毒素、其發酵產物可直接用于食品生產中等優點，具有良好的工業應用前景。隨著研究的不斷深入及對芽孢桿菌的多種特性的揭示，芽孢桿菌的研究已在多種領域開展[31]，并利用枯草芽孢桿菌實現了某些外源基因的表達[32-35]，且所表達的蛋白保留原有的生物學活性[36]，但尚未見利用枯草芽孢桿菌實現海洋源MT的報道。本研究運用八種蛋白酶缺陷的枯草芽孢桿菌WB800N作為宿主，實現SUMO(Small ubiquitin-related modifier)與海洋源MT在枯草芽孢桿菌WB800N中融合表達，得到可溶性目的蛋白，成功實現了海洋源金屬硫蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌表達，并獲得具有活性的海洋源金屬硫蛋白，為解決制約MT產業發展原料來源瓶頸、開發天然高效海洋源重金屬生物解毒劑提供理論依據，也為實現海洋源MT的工業化生產奠定了基礎。

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