鏈狀亞歷山大藻谷氨酰胺合成酶的分離純化及酶學特性研究

(福建省海洋環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

不管是高等植物還是低等植物，氮素的同化都是一個非常重要的生理過程。無機氮只有被轉化為有機氮，才能被植物細胞所吸收利用。細胞內氮的吸收同化過程有三個主要步驟：第一步是氮的跨膜運輸，環(huán)境介質中的氮被轉運到細胞內；第二步是硝酸鹽在硝酸還原酶(NR)和亞硝酸還原酶(NiR)作用下轉化成氨；第三步是氨在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下被轉化為有機氮。GS作為細胞內氮和碳同化的樞紐，在這一同化過程中起著關鍵性的作用[1-5]。

海洋赤潮是一個嚴重的生態(tài)問題，尤其是有毒赤潮，越來越引起重視。鏈狀亞歷山大藻是全球分布較廣的有毒赤潮藻種，能產生麻痹性貝類毒素(PSP毒素)，毒害人類、鳥類和魚類[6-8]。本研究以鏈狀亞歷山大藻為實驗材料，通過離子交換、分子篩和疏水層析等純化技術來分離純化GS，并對GS的理化特性進行研究，為從生物化學角度更深入認識鏈狀亞歷山大藻對氨的同化機制及氮營養(yǎng)生理提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

鏈狀亞歷山大藻分離自長江口，由廈門大學近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室種質中心提供。藻種培養(yǎng)條件是光照周期(光照14 h，黑暗10 h)，光照強度為4 000 Lux，培養(yǎng)溫度為21℃。實驗用海水采自臺灣海峽外海水。海水經過0.45 μm孔徑的濾膜過濾后，高溫滅菌，然后保存在黑暗處。

藻類培養(yǎng)采用半連續(xù)培養(yǎng)的方法。鏈狀亞歷山大藻經缺氮f/2培養(yǎng)基馴化后，添加硝酸鹽并在第二天GS活力達到最高值后，收集藻細胞用于GS的分離純化。

1.2 實驗方法

1.2.1 GS活力測定

在富集得到的藻細胞中加入1 mL GS抽提液，超聲破碎(功率280 W，2 s)，間隔時間2 s，破碎次數40次，破碎后的藻細胞在70 000×g下離心50 min，每mL上清液中加入100 mmol/L、pH 7.0的鏈霉素硫酸鹽0.1 mL，充分混合均勻后在70 000×g下離心50 min，得到GS粗提液，按照Bernard等的方法測定GS活力[9]。

1.2.2 GS純化

用孔徑5 μm篩絹過濾收集藻液90 L，離心濃縮至50 mL離心管中(8 000×g，10 min)。加入酶抽提液buffer A(2 mL/g)：50 mmol/L tris-HCl、pH=7.5、2 mmol/L DTE、1 mmol/L EDTA 和2.5 mmol/L MgCl2，冰浴超聲破碎，功率為280 W，間隔時間/工作時間=2 s/2 s，破碎5 min。破碎后的粗提液加入一定量的酶抽提液在70 000×g下超高速離心，溫度4℃，時間50 min。取上清液加入200 μL的鏈霉素(100 μL/mL)混勻，在70 000×g超高速離心，50 min。上清液用0.45 μm孔徑的膜過濾。粗提液通過預先用buffer A平衡過的DEAE-Seoharose column(2.6 cm×25.0 cm)，采用0.15至1.00 mmol/L 的NaCl梯度洗脫，收集各組分，測定GS活力。洗脫速度4 mL/min，總洗脫體積400 mL。將DEAE-Seoharose收集到的酶液用超低溫真空濃縮至3 mL，用Sephacry1 S-300分子篩柱(1.6 cm×100.0 cm)進一步純化，用含0.15 mol/L的NaCl緩沖液洗脫，收集各組分，測定GS活力。獲得的酶液用超低溫真空濃縮至3 mL，經Phenyl-Sepharose CL-4B層析柱(1.6 cm×20.0 cm)進一步純化，收集各組分，測定GS活力。

1.2.3 GS亞基分子量測定

根據Davis[10]的方法，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定亞基分子量。

1.2.4 總分子量測定

采用Sephacry1 S-300分子篩柱(1.6 cm×100.0 cm)分離的方法確定。

1.2.5 GS特性研究

反應最適溫度和最適pH：GS活力反應溫度梯度分別為5、10、15、20、25、30和40℃，pH梯度分別為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0和10.0。

金屬離子對GS活力的影響：選擇Fe3+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、K+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Ce2+和Mg2+金屬例子，反應濃度均為0.5 M。

1.2.6 蛋白含量測定

根據Bradford[11]的方法測定收集峰的蛋白含量，以牛血清蛋白作為標準蛋白。

2 實驗結果

2.1 GS純化

GS粗提物經離子交換柱梯度洗脫結果見表1。DEAE-Sepharos柱(2.6 cm×25.0 cm)經緩沖液預平衡后，用0.15～0.50 mol/L NaCl線性梯度洗脫GS粗提物，根據快速蛋白檢測結果分步收集各組峰，并對收集峰進行GS活力測定，當NaCl濃度洗脫至0.32 mol/L時，GS蛋白被洗脫下來，GS活力為3.55 U·mg-1protein。GS凝膠過濾層析洗脫結果表明離子交換層析所得GS樣品經冷凍干燥后濃縮至3 mL，上樣至Sephacry1 S-300凝膠層析柱中，用0.15 mol/L NaCl抽提緩沖液進行洗脫，收集洗脫峰進行GS活力檢測，GS活力為15.6 U·mg-1protein。將凝膠過濾層析所得GS樣品，上樣至Phenyl-sepharose CL-4B疏水層析柱中，用含70%乙二醇緩沖液進行洗脫，收集洗脫峰進行酶活檢測，GS活力為19.86 U·mg-1protein。

2.2 GS分子量及亞基分子量確定

鏈狀亞歷山大藻GS分子量采用凝膠過濾法來確定。標準蛋白峰洗脫體積分別為：藍色葡聚糖(Blue dextran)2 000，45.45 mL；甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin)，54.35 mL；鐵蛋白(Ferritin)，60.09 mL；醛縮酶(Aldolase)，66.53 mL；伴白蛋白(Conalbumin)，69.84 mL；卵清蛋白(Ovalbumin)，71.00 mL。GS樣品峰洗脫體積為60.35 mL，通過計算得出GS分子量為430 kD。

鏈狀亞歷山大藻GS亞基分子量通過變性凝膠電泳來確定，見圖1，通過換算得到亞基分子量大小為55.6 kD。

2.3 GS酶學特性研究

純GS酶學特性結果表明鏈狀亞歷山大藻GS反應的適宜pH范圍為7.5到9.5，其中最大酶活力pH為8.0(圖2)。GS活力隨溫度的增加而增加，至25℃時，GS活力達到最大，而后隨溫度的進一步增加而降低(圖3)。金屬離子對GS活力影響較大：Fe2+和Fe3+離子參加的反應中未檢測到酶活力，Mg2+離子參加的反應中酶活力最高，Cu2+、Ce2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、Zn2+和K+對GS活力有不同程度的抑制作用(圖4)。

3 討論

鏈狀亞歷山大藻GS粗提物經DEAE-Sepharose離子交換、Sephacry1 S-300分子篩凝膠過濾和Phenyl-sepharose CL-4B疏水層析等分離純化步驟后，最終得到純化的GS，純化倍數為130，酶活為19.86 U·mg-1protein，其中在離子交換層析過程中，GS量損失最大，但純化倍數最高(表1)。GS的催化作用受到環(huán)境因子的影響，反應環(huán)境中溫度、pH和離子強度等因素的變化都會影響酶的活力，特別是經過抽提及純化過程處理后，導致酶損失較大，加上鏈狀亞歷山大藻中GS含量極低，致使得率比較低，因此在進行GS純化時，純化速度要快，操作要連續(xù)。

Mann等[12]、Hirel等[13]研究表明，植物細胞中的GS同功酶因定位不同而產生差異，根據細胞中分布，分為GS1和GS2，GS1以細胞質型GS形式存在；GS2以葉綠體型GS形式存在。根據組成GS單體分子量差別，分為GSⅠ、gGSⅡ和gGSⅢ。Kumadaet等[14]、Amaya[15]等認為GSⅠ廣泛分布在細菌、古細菌、真核生物中，其亞基分子量大小為55 kD；GSⅡ分布在植物共生菌、真核生物中，其亞基分子量大小為36 kD；GS Ⅲ分布在藍細菌中，其亞基分子量為75 kD；相對于GSⅠ，GSⅡ和GSⅢ分布的種類很有限。Meister[1]和Kleinschmidt[16]研究表明，植物和動物組織來源的GS的分子量一般在400 kD左右，有8個相同的亞基組成，但在不同細菌類群中，GS分子量大小差別較大。本實驗結果表明，鏈狀亞歷山大藻的GS分子量大小為430 kD，由8個分子量為55.6 kD亞基組成。根據亞基分子量大小判斷，鏈狀亞歷山大藻GS屬于GSⅠ類型。

表1 鏈狀亞歷山大藻GS純化

pH是影響酶活力的一個重要因子。細胞或生物體內的酶常常在某一pH范圍內才表現出較大活力，而表現出酶最大活力時的pH稱為酶的最適pH。pH對酶反應速率的影響，一方面是由于酶本身是蛋白質，過酸或過堿易使酶變性失活；另一方面是pH影響了酶分子的活力中心上有關基團的解離或底物的解離，影響酶與底物的結合，從而影響酶的活力。研究表明，不同生物其GS反應的最適pH范圍也不相同。Ahmed等[17]研究多種海洋浮游植物GS反應最適pH范圍時發(fā)現，GS反應的最適pH范圍為7.0到8.0。Bressler等[2]報道，中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)、魯茲帕夫藻(Pavlovalutheri)、偽矮海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)等GS的最適反應pH為7.0到7.8。García-Fernández等[18]報道Monoraphidriumbraunii綠藻的 GS反應最適pH范圍為7.5 到8.0。Kim等[19]在研究Klebsiellapneumoniae細菌GS在 pH為8.0時酶活力最大。本研究發(fā)現，鏈狀亞歷山大藻GS反應較適pH范圍較廣，為7.5～9.5，其中最大酶活力為pH 8.0。

溫度是影響酶活力的另一個重要因子。絕大多數酶在低溫時酶反應進行緩慢，當溫度逐漸升高時，反應速率也逐漸升高，達到最高值后，反應速率隨溫度的進一步升高迅速降低[1]。在一定條件下，一種酶只在某一溫度時活力最大，該溫度就是酶反應的最適溫度。鏈狀亞歷山大藻GS在溫度5～40℃范圍均能反應，最適的反應溫度為25℃。

GS參加的反應需要在一定金屬離子作為底物的條件下才能進行，且對金屬離子具有選擇性。Kim等[19]在研究Klebsiellapneumoniae細菌GS特性發(fā)現，該菌GS在金屬Mn2+、Cu2+、Ni2+存在下，GS活力能表達，而在Fe2+、Fe3+、K+、Pb2+、Zn2+、Ca2+、Ce2+存在下GS活力為0。Kameya[20]等在研究嗜熱鏈球菌(Hydrogenobacterthermophilus)時也發(fā)現GS在金屬Mg2+離子存在下活力最高。本研究發(fā)現Cu2+、K+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Ce2+和Mn2+對GS有不同程度的抑制作用，Fe2+和Fe3+則完全抑制了GS的活力，而在Mg2+離子存在下活力最高(圖4)。

4 小結

1)鏈狀亞歷山大藻GS粗提物經DEAE-Sepharose離子交換、Sephacry1 S-300分子篩凝膠過濾和Phenyl-Sepharose CL-4B疏水層析等處理后，得到純的GS，分子量為430 kD，由8個分子量為55.6 kD的亞基組成。按照亞基分子量的大小判斷，鏈狀亞歷山大藻GS屬于GSⅠ類型。

2)GS反應的最適pH和溫度分別為8.0和25℃。Mg2+離子參與的GS反應，GS活力表達最高，Cu2+、K+、Zn2+、Ni2+、Ca2+、Ce2+、Mn2+對GS活力均有一定的抑制作用，Fe2+和Fe3+則完全抑制了GS活力。

3)本研究從鏈狀亞歷山大藻中分離、純化GS，但所做工作還比較初步，對GS的認識還有待進一步深入研究，如GS的分子調控機制和不同營養(yǎng)鹽條件下GS的表達等，有助于更加深入地認識鏈狀亞歷山大藻的氮營養(yǎng)生理特性和赤潮形成的營養(yǎng)學機制。

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