葉黃素和蝦青素對大黃魚體色及抗氧化能力的影響

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(集美大學水產學院，農業部東海海水健康養殖重點實驗室，福建 廈門 361021)

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國傳統“四大海產”之首，目前是我國養殖產量最高的海水魚類，為我國八大優勢出口養殖水產品之一[1]。由于長時間人工增養殖，缺乏有效良種選育，加之養殖環境惡化及配合飼料與天然餌料之間的營養差異，造成養殖大黃魚出現體色退化、體脂含量過高、抗病力下降等現象，極大地影響其商品價值及養殖效益。因此，如何改善大黃魚的體色并提高其免疫能力是大黃魚產業亟需解決的問題。

類胡蘿卜素分為胡蘿卜素類和葉黃素類，其中蝦青素和葉黃素屬于葉黃素類。研究表明，類胡蘿卜素不僅能有效改善養殖魚類的體色[2-4]，還因其分子結構中含多個共軛雙鍵，能夠有效地清除動物體內的自由基，減少自由基對細胞遺傳物質和細胞膜的損傷而具有抗氧化作用，此外還能增強動物的免疫力，促進動物生長和提高成活率[5]。投喂添加蝦青素飼料的大黃魚親魚體內抗氧化能力顯著增強[6]。飼料中添加蝦青素、葉黃素飼喂大黃魚幼魚9周能顯著提高其皮膚的紅色值和黃色值[7]。飼料色素對魚類體色及抗氧化能力的影響因魚種、個體大小、色素添加水平及投喂時間不同會產生不同效果。大黃魚幼魚通過攝取外源色素取得的鮮艷顏色在停喂添加色素的飼料后，其體色能否保持至成魚階段目前仍不清楚?？紤]到全程投喂添加色素飼料會大幅度提高飼料成本，因此本研究旨在探討類胡蘿卜素(蝦青素和葉黃素)對大黃魚成魚(商品規格)體色和肝臟抗氧化能力的影響效果，以期為飼料色素在大黃魚的健康養殖及品質改良上的應用提供一些參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

本試驗用的大黃魚由福建省寧德市橫嶼島水產有限公司所提供，從海上網箱挑選商品規格平均體質量(365.54±5.83)g大黃魚2 000尾，并移入室內水泥池馴養一段時間后，開始試驗。

1.2 試驗飼料

用市售大黃魚粉狀飼料為基礎飼料，分別在飼料中添加10%魚油和不同劑量(0 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg)葉黃素和蝦青素(1∶1)混合色素，再加適量水調成糊狀，用軟顆粒飼料機制成4種含不同色素水平的軟顆粒飼料。基礎飼料的粗蛋白質、粗脂肪和粗灰分含量分別占干物質的44.4%、16.6%和9.9%，各試驗組飼料色素具體添加量見表1。

表1 各試驗飼料中葉黃素與蝦青素添加量

注：添加量根據葉黃素實際含量為2%，蝦青素實際含量10%進行換算。

Note：The added amount of feed pigment was calculated by actual contents of xanthophyll(2%)and astaxanthin(10%).

1.3 飼養試驗

以基礎飼料+10%魚油的飼料組為對照組(無添加色素，D1組)，在對照組飼料中分別添加葉黃素和蝦青素(1∶1)混合色素100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg的飼料，并分別命名為D2組、D3組和D4組，每組設3個重復，每個重復放150尾飼養于規格為4.0 m×3.5 m×1.8 m室內水泥池，試驗為期60 d。

將從海上網箱移入室內水泥池的大黃魚用對照組飼料馴化直至能攝食配合飼料后開始進行正式飼養試驗，試驗期間每天投喂飼料2次(上午06∶00，下午17∶00)直至大黃魚不搶食為止，下午投喂后1 h吸污，每天上午07∶00換水一次，試驗期間水溫為18.4～23.4℃，pH為7.8～8.0，鹽度為 27～29，溶解氧>5 mg /L，氨氮濃度<0.05 mg /L。

1.4 取樣及指標測定

1.4.1 皮膚色差值的測定

試驗中期及試驗結束時各取樣一次，取樣時間在晚上20∶00～22∶00進行。每個重復隨機撈取10尾魚，用毛巾遮住其眼部以避光，并按住其尾部，使用便攜式色彩色差計CM-700d/600d(柯尼卡-美能達，日本)逐尾測定大黃魚背部及腹部色差值。按照國際發光照明委員會(OE，1976)的規定，分別用L*、a*和b*代表亮度值、紅色值和黃色值。色差計使用前用白板進行校準，測定過程中都應避免外源光線對大黃魚體色的測定造成影響。

1.4.2 肝臟抗氧化指標測定

試驗結束時(60 d)，每個重復取大黃魚6尾解剖，取出肝臟，每3尾魚肝臟合并混勻為一樣品，每組共6份樣品，分裝于塑料封口袋，貯存于液氮罐中帶回實驗室測定。測定時，取1 g以上的肝臟用冰冷的生理鹽水清洗3次后，放到吸水紙上吸干水分，再稱取0.5 g組織放入試管中，按比例加入生理鹽水(9 mL生理鹽水∶1 g樣品)，用超聲反復粉碎(400 A，5 s/次，間隙10 s)3～5次。之后放入低溫高速離心機以3 000 r/min離心10 min，制得10%組織勻漿液。各指標測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行檢測，具體操作參照各試劑盒說明書進行。

1.5 數據分析

相關數據用SPSS22統計軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，若差異顯著，則采用LSD多重比較法檢驗各濃度組之間的差異，差異顯著P<0.05。

2 結果

2.1 飼料色素對大黃魚體色的影響

試驗中期(30 d)，各組大黃魚體色測定結果如表2所示。由表2可知，各試驗組之間大黃魚背部及腹部皮膚亮度值(L*)和紅色值(a*)均無顯著性差異(P>0.05)。但是色素添加組(D2～D4)大黃魚背部皮膚的黃色值(b*)顯著高于對照組(D1)(P<0.05)。其中，D4組顯著高于D2和D3組，D2與D3組之間無顯著差異(P>0.05)。同樣，腹部皮膚的黃色值(b*)色素添加組均顯著高于對照組(P<0.05)，其中D2組和D4組結果無顯著性差異(P>0.05)，但都顯著高于D3組(P<0.05)。

試驗結束時(60 d)，各組大黃魚體色測定結果如表3所示。由表3中可知，背部皮膚中的亮度值(L*)測定結果為D4組顯著低于D1、D2和D3組(P<0.05)，D1、D2和D3組之間均無顯著性差異(P>0.05)。在腹部皮膚的亮度值(L*)測定結果為D2和D3組顯著低于D1和D4組(P<0.05)，其中D2和D3組、D1和D4組之間無顯著性差異(P>0.05)，各組之間大黃魚背部皮膚的紅色值(a*)均無顯著性差異(P>0.05)，D3組腹部皮膚的紅色值(a*)顯著高于其他試驗組(P<0.05)。各色素添加組之間背部皮膚和腹部皮膚的黃色值無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 試驗30 d后飼料色素對各組試驗魚體色的影響

注：同一列中肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。L*：亮度值；a*：紅色值；b*：黃色值。

Notes：In the same row，values with no letter or the same letter superscripts meant no significant difference(P>0.05)，while with different small letter superscripts meant significant difference(P<0.05).The following tables were the same as here.Brightness value was short for L*，red value was a*and yellow value was b*.

表3 試驗60 d時飼料色素對各組試驗魚體色的影響

2.2 飼料色素對大黃魚抗氧化能力的影響

各組大黃魚肝臟總抗氧化能力(T-AOC)活力如表4所示。D4組大黃魚肝臟T-AOC活力最高(4.71 U/mgprot)，顯著高于D2和D3組，但D2和D3組之間差異不顯著(P>0.05)。對照組(D1)大黃魚肝臟T-AOC活力最低，顯著低于其他組(P>0.05)。各組大黃魚肝臟的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性都隨著色素添加水平的增加呈現先上升后下降趨勢，D4組兩種酶活性均顯著低于D3組；D2和D3組SOD酶活性無顯著差異，但都顯著高于D1組(P<0.05)；而D3組CAT活性則顯著高于其他組，但D2和D4組之間無顯著差異(P>0.05)。D1和D2組肝臟丙二醛(MAD)含量分別為23.55 nmol/mgprot和23.62 nmol/mgprot，顯著高于D3(5.79 nmol/mgprot)和D4(2.04 nmol/mgprot)組，且D4組顯著低于D3組(P<0.05)。

表4 飼料色素對大黃魚肝臟抗氧化指標的影響

3 討論

3.1 飼料色素對大黃魚體色的影響

類胡蘿卜素除了能用于改善動物體色外，還具有其它功能，如促進魚類的生長、提高魚類的抗病能力和親魚的繁殖性能等[8-10]。類胡蘿卜素在水產動物上的應用已有不少報道，在雜交大口鲇(CrossNikolskyet)飼料添加類胡蘿卜素的飼養試驗中發現，隨著類胡蘿卜素添加量的增加，大口鲇的體色改善效果越明顯[11]。在飼料中添加葉黃素對雜交鯰(SilurusmeridionalisChen×Silurusasotus)、金魚(Carassiusauratus)、血鸚鵡魚(Cichlasomasynspilum♀×Cichlasomacitrinellum♂)[12-14]等魚類的體色都有良好的改善效果。添加蝦青素的飼料喂養中國金魚后發現金魚著色自然，通過化學分析得知金魚體內的蝦青素是以酯化的形式存在。不同魚類對蝦青素的沉積能力不同，這是導致其體內蝦青素含量差異大的原因之一[15]。養殖大黃魚的皮膚顏色均有不同水平的退化，主要是由于投喂餌料中缺乏大黃魚自身不能合成的類胡蘿卜素而造成的。從本研究結果可以看出，通過30 d投喂添加葉黃素和蝦青素飼料后，投喂含色素的飼料組與對照組大黃魚皮膚的亮度值沒有顯著差別，這與澳大利亞笛鯛(Pagrusauratus)皮膚的亮度值并未受飼料色素的影響的結果相似[16]。大黃魚背部皮膚的亮度值低于腹部皮膚的亮度值可能是由于背部皮膚中黑色素含量高于腹部皮膚中黑色素含量而造成的[17]。隨著色素添加量的提高，大黃魚背部皮膚黃色值越高，腹部皮膚的黃色值反而降低，但總體相對于對照組來說都有顯著性的提高。這可能是背部皮膚和腹部皮膚對不同色素的沉積效果不同所致。從60 d的實驗數據結果中可知，隨著投喂時間的延長，不管是背部或腹部皮膚的黃色值，各實驗組之間的差異并不顯著，皮膚黃色值已趨于穩定值。本試驗大黃魚背部及腹部黃色值比大黃魚幼魚更快地達到穩定值的原因除了受遺傳因素影響外，主要可能是與本試驗魚個體較大和色素添加水平較高有關[7，18]。本實驗由于兩次測定時間間隔較長，雖然從試驗結果可以看出大黃魚皮膚黃色值趨于穩定值的時間在試驗后30～60 d，但具體在哪個時間點，還有待于進一步研究。本試驗結果表明，利用外源色素對上市前大黃魚進行體色調控是有效可行的，并且可以節約色素的使用成本。此外，不同魚類對類胡蘿卜素的利用率不同，如斑點叉尾魚回(Ictaluruspunctatus)能更好積累黃色素、黃體素和玉米黃質于皮膚中形成黃色體色[19]；大西洋鮭(Salmosalar)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)對蝦青素的積累能力比角黃素高[20-21]。本實驗中大黃魚皮膚黃色值遠高于紅色值，這表明大黃魚對葉黃素的利用率高于蝦青素，這與Yi X等[7]對大黃魚幼魚的研究結果相似。

3.2 飼料色素對大黃魚抗氧化能力的影響

動物在正常的生理狀態下，活性氧自由基不斷產生又不斷地被清除，處于動態平衡，從而避免它們對機體造成傷害。其清除機理主要是依靠體內的總抗氧化防御體系，包括酶促(SOD和CAT等)和非酶促體系(維生素、氨基酸、蝦青素、金屬蛋白等)[22-24]。

總抗氧化能力(T-AOC)是衡量機體抗氧化系統功能狀況的綜合性指標。崔惟東等[25]在飼料中添加蝦青素 、角黃素，結果表明其均可提高虹鱒肝臟總抗氧化能力。本研究結果也證實了在飼料中加入蝦青素和葉黃素能夠提高大黃魚肝臟的總抗氧化能力(T-AOC)，隨著飼料中色素添加量的升高，大黃魚肝臟T-AOC值也相應升高。

生物機體內的活性氧和自由基的累積將會導致生物體代謝紊亂，酶促和非酶促體系都能產生過氧化氫(H2O2)，它是活性氧的前體，有毒害作用[26]。CAT能清除H2O2，還能分解其他的有害物質。趙吉偉等[27]對野生及養殖茴魚體內ACP、AKP和CAT活力的比較研究表明，CAT清除有害自由基的作用在肝臟中最強，以運動為主的肌肉組織中則相對較弱。本研究結果顯示D3組大黃魚肝臟的CAT活性最高，D2組次之，對照組最小，表明在飼料中加入蝦青素和葉黃素，能夠提高大黃魚肝臟CAT的活性，使大黃魚清除體內H2O2的能力和分解其他有害物質的能力增強。

超氧化物歧化酶(SOD)對平衡機體的氧化與抗氧化過程起著至關重要的作用，此酶能夠清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。因此，可以通過檢測超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性的變化，來反映機體內的抗氧化狀況。李建光等[28]在飼料中添加蝦青素、葉黃素、辣椒紅素和胡蘿卜素阿卜酯四種增色劑，研究其對錦鯉的生長、形體、體色和抗氧化能力的影響，結果表明增色劑能夠提高錦鯉的抗氧化能力，隨著蝦青素添加量的增大，肝胰臟SOD值呈上升的趨勢。本試驗結果也表明在飼料中加入蝦青素和葉黃素能夠提高大黃魚肝臟的SOD酶活性，但是色素的過量添加(300 mg/kg)反而使肝臟的SOD活性出現下降趨勢，具體原因有待深入研究。

魚類在進行正常的生理活動過程中，會產生一定量的氧自由基，氧自由基的產生與消除通常處于動態平衡狀態。如果魚類遇到外源刺激或者內源刺激，機體就會產生過多的氧自由基，導致原有的平衡被破壞，從而產生氧化壓力，氧化壓力有時會對魚類造成氧化損傷并促進脂質的過氧化反應[29-30]。氧自由基可以通過過氧化生物膜中多不飽和脂肪酸來引起細胞損傷，還可以通過分解脂氫過氧化物產生可引起細胞損傷的物質。MDA含量可以用來衡量脂質的過氧化程度。趙鑫鑫[31]等分別用添加了100 mg/kg 的蝦青素和辣椒紅素飼料飼養金魚和錦鯉，結果表明蝦青素組和辣椒紅素組的金魚以及錦鯉的血清和肝臟的MDA含量均顯著低于對照組。而本試驗中大黃魚肝臟的MDA含量也隨著色素添加量的提高而降低，表明飼料中加入蝦青素和葉黃素可顯著降低脂質過氧化程度。

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