冬蟲夏草的培養及菌種鑒定

摘 要：冬蟲夏草是我國的傳統中藥材，分布廣泛，種類繁多。本文對采自新疆的野生蟲體進行分離培養，并進行菌種的純化、染色分析及鑒定，結果表明分離到的真菌是冬蟲夏草（Cordyceps scarabaeicola）。并經過染色分析確定其形態學特點，為下一步蟲草試驗分析與基因修飾奠定良好的基礎。

關鍵詞：冬蟲夏草；分離培養；18SrDNA；菌絲

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）屬于子囊菌綱（Ascomycetes）肉座菌目（Hypocreales）麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）真菌。野生蟲草生長于海拔較高的寒冷區域，主要分布于我國云貴高原。冬蟲夏草性甘味溫，藥用價值極高，在保肺益腎、止咳化痰、止血、抗癌等方面效果良好[1-2]。

一、試驗材料

（一）真菌材料

試驗材料是冬蟲夏草的蟲體部分，試驗中所用的蟲草菌絲分離自該蟲體部分。DNA提取試劑盒購自美國OMEGA公司的Fungal DNA Mini Kit，引物的合成與測序由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

（二）培養基

改良CYM培養基[3-4]，1 L培養基含麥芽糖10 g、葡萄糖15 g、酵母粉2 g、蛋白胨2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4.6 g和維生素B1 0.3 g，pH值自然，固體培養基含0.8%～1.0%瓊脂。

二、試驗方法

（一）蟲草真菌的分離及純化

1.蟲草菌絲的分離

首先將蟲體清洗干凈，在超凈工作臺內吹干水分，選取中間部分用解剖刀切成1.0～1.5 cm的小段。然后進行表面消毒，用75%酒精沒過蟲段浸泡3～

5 min，0.1%升汞浸泡15 min，間隔2～3 min搖晃幾次，去掉兩端各約0.1 cm的部分，用消毒解剖刀縱切后接種于真菌培養平板上培養，待真菌長出后用無菌的接種針挑取頂端少量菌絲轉接于真菌培養基上進行繼代培養。

2.蟲草真菌的純化

將分離到的菌絲轉接于加有抑菌素的真菌培養基中連續培養七八次以達到純化的目的。將純化好的真菌接于斜面培養基上保存于4 ℃冰箱及28 ℃培養箱中備用。

（二）蟲草真菌菌絲染色

用棉蘭染色劑對菌絲進行染色[5-6]。制成臨時裝片，10 min后在Olympus顯微鏡下觀察其形態特點。

（三）蟲草真菌基因組DNA的提取

稱取菌絲2 g，液氮研磨。按照提取試劑盒的操作說明提取DNA。

（四）蟲草真菌18S rDNA的擴增

根據真核生物18SrDNA保守序列設計引物18SrDNA（up）和18SrDNA（down）[7]。

用DNAMAN生物學軟件設計引物，18SrDNA（up）：5’-agcgaaactgcgaatggc -3’；18SrDNA（up）：5’-catccttggcaaatgctttc -3’。

然后，在25 μL的PCR反應體系中加入：DNA模板2 μL，2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，相應的引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 8.5 L。之后進行PCR反應。PCR反應條件為：94 ℃預變性6 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫1 min。

最后，將PCR凝膠切下送北京擎科新業生物技術有限公司測序。

三、試驗結果

（一）蟲草菌絲的試驗培養

分離到的菌絲接種于改良CYM培養基，20 ℃下培養，繼代后一般第3天開始有生長跡象，菌絲細長（見圖1）。

（二）蟲草菌絲的染色分析

通過棉蘭染色對蟲草菌絲進行形態學觀察，結果如圖2所示。從圖2可知，蟲草菌絲較其他真菌而言菌絲略粗，故而肉眼觀察時菌絲細長濃密。圖2中A、B在不同的折光效果下拍照，兩種效果結合可知，菌絲有分枝、有橫隔。

（三）蟲草菌絲基因組18S rDNA的擴增

經1%瓊脂糖凝膠電泳，真菌DNA的18S rDNA PCR擴增結果見圖3，共做2個平行對照，序列大小約為900 bp。

（四）蟲草真菌測序結果分析

按照真菌保守序列18S rDNA設計的引物進行測序，結果擴增到長度為876 bp的基因序列，如圖4所示。將所得的真菌序列在NCBI上進行BLAST比對確定其為冬蟲夏草（Cordyceps scarabaeicola），同源性為99%。

四、結論

本文對野生蟲體進行了真菌的分離與培養，將純化好的菌絲進行真菌基因組DNA的提取，并對真菌保守序列進行PCR，結果顯示得到的序列為876 bp的堿基。將該結果放在NCBI上進行BLAST比對，確定其為冬蟲夏草（Cordyceps scarabaeicola），同源性為99%。通過該試驗的研究可以為蟲草的實驗室培養及基因修飾打下基礎。（基金項目：河套學院科學技術研究項目自然科學青年項目，項目編號：HTXYZQ13010）

參考文獻：

[1]丘雪紅，曹莉，韓日疇.冬蟲夏草的研究進展、現存問題與研究展望[J].環境昆蟲學報，2016（1）：1-23.

[2]Hodge KT，Krasnoff SB，Humber RA. Tolypocladium inflatum is the anamorph of Cordyceps sub-sessils[J]. Mycologia，1996（88）：715-719.

[3]帖衛芳，賈俊忠.冬蟲夏草培養條件的優化[J].河套學院學報，2015（4）：76-77.

[4]趙潤，郭成金.冬蟲夏草菌絲體液體培養基的優化[J].天津師范大學學報（自然科學版），2008（1）：8-11.

[5]黃霞云，劉晶杰.真菌染色新方法的探索[J].實用醫技雜志，2006（13）：1862-1863.

[6]陳倪勇，肖永波.介紹一種真菌的染色方法[J].中華病理學雜志，2001（5）：383-384.

[7]Noriko Kinjo，Mu Zang. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China[J]. Mycoscience，2001（42）：567-574.