納米二氧化鈦對佳樂麝香所引起的沙蠶（Perinereis aibuhitensis）神經毒性的影響

張倩茹 ，姜麗思 ，牟文燕 ，王建美 ，李斯雯

（1.中國科學院沈陽應用生態研究所 污染生態與環境工程重點實驗室，沈陽 110016；2.廣東省環境污染控制與修復技術重點實驗室，廣州 510275；3.中國科學院大學，北京 100049）

隨著化學分析技術的提高和人們環境意識的增強，環境中藥品及個人護理品（Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs）已日漸引起廣泛關注，而我國是PPCPs生產和使用大國。合成麝香作為天然麝香的廉價代替品，由于其具有易于制得、多種特殊氣味和良好的提香、定香能力等優點，被廣泛應用于日用化工行業，如作為香料添加到化妝品（香水、肥皂、洗發水和面霜）和洗滌劑（柔順劑、沐浴露和香波）中。由于其持續不斷地進入環境并能夠在生物體內積累，其效應類似于持久性污染物。佳樂麝香（HHCB）是目前使用量最多的一種人工合成麝香，僅2000年歐洲年使用量就達1427 t[1]。由于麝香類物質的分子結構中含有疏水性官能團，很容易吸附在污水處理系統內的沉積污泥中，當這些污泥進入土壤或地表徑流及地下水時，會造成生態環境的有機污染。直接或間接排放的污水、污泥回用或垃圾填埋是人工麝香進入環境的主要途徑[2]。HHCB作為多環麝香的典型代表，在環境中的濃度日益升高，由于人工合成麝香在環境中穩定性好，對生態系統的穩態存在著潛在威脅，其生態毒理效應日漸受到關注。目前研究表明，多環麝香對水生生物具有亞急性毒性、弱雌激素與抗雌激素效應以及抑制多種藥物的外向轉運蛋白等毒性效應，同時在水體、大氣和污泥等環境介質甚至人體脂肪和母乳中均已檢測出HHCB[3]。多環麝香可通過影響機體對污染物的外排機制，抑制其活性，使有毒物質在體內蓄積進而損傷機體[4]。Luckenbach等[5]已證實多環麝香可以顯著抑制加州貽貝（Mytilus californianus）細胞的外排型轉運體活性。除此之外，大量研究表明，HHCB能明顯抑制水生生物幼蟲的生長發育[6]以及促進人體胚腎細胞的繁殖[7]。目前也有研究關注人工合成麝香及其復合污染對動、植物及微生物的毒性作用[8]。律澤等[9]研究表明，HHCB和Cd單一、復合污染對土壤細菌和真菌數量都有顯著影響。王雯等[10]研究表明，在吐納麝香（AHTN）和Cd聯合暴露情況下，高劑量AHTN對赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida）金屬硫蛋白與谷光甘肽均產生了抑制作用[10]。由于多環麝香可能通過影響多重耐藥外排型轉運體（Multidrug/multi-xenobiotic resistance efflux transporters）的活性而使生物體對外源化合物的排斥力減弱，因此，即使在停止多環麝香暴露后，通常被機體排斥的毒物仍然會進入細胞內部，持續積累[5]。

納米TiO2是應用十分廣泛的納米材料之一，工業上稱作鈦白粉[11]。由于納米TiO2與常規物質相比有著尺寸小、比表面積大、表面活性高等特點，因此具有一系列不同于傳統金屬氧化物材料的特殊物理化學性質。納米TiO2具有很強的吸收和散射紫外線能力，無刺激性，可用于化妝品等行業[12]。研究發現，納米材料的多種水環境行為，使其特性等發生改變，進而影響納米材料的水生生物毒性[13]。納米TiO2能夠阻礙魚腥藻（Anabaena variabilis）細胞的固氮活性[14]，其在日光照射情況下能破壞綠藻（Chlorophyta）、剛毛藻（Cladophora）、鞘藻（Oedogonium）等細胞結構，降低光合作用，導致藻類生長受到抑制[15-16]。此外，斑馬魚（Danio rerio）在長時間低劑量納米TiO2的慢性暴露下，隨暴露時間的延長和濃度的增加，受到的毒副作用日趨明顯，肝體比上升[17]。隨著納米工程材料在世界范圍內的廣泛應用，其可以通過空氣、水、土壤、廢物處置、食物鏈等多種途徑進入生態環境，對生態環境及安全將產生何種影響還了解得不全面。目前針對納米TiO2對生物的毒性效應研究開展較多，但對于納米TiO2與其他污染物組合或相互作用而產生的毒性效應還知之甚少。特別是作為環境修復材料用于處理一些新興有機污染物過程中，可能帶來的復合污染生態風險還鮮有報道，因此，有必要開展新興有機和無機復合污染毒性效應研究。

乙酰膽堿酯酶（AChE）是生物體內一種重要酶類，其作用是水解乙酰膽堿。乙酰膽堿是生物化學傳遞所必需的，但是它在釋放后必須迅速分解，否則該物質的積累反而會引起神經傳遞的阻斷[18]。早在20世紀50年代末就有研究將魚腦或無脊椎動物AChE的抑制程度作為污染評價指標[19]。研究表明，海洋無脊椎動物AChE是一種最為敏感且易獲得的生物標記物[20]。AChE活性高低常作為有機磷農藥和神經毒劑中毒的重要診斷指標[21]，由于有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥對生物體內AChE的抑制十分顯著，利用農藥對AChE活性的抑制，可表征環境樣品中有機磷農藥的含量[22]。對血漿AChE活性的測定還有助于血管性癡呆病的鑒別診斷[23]。目前，國內外對AChE的研究較多，AChE已成為環境科學和生態毒理學常用的污染評價指標。

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）屬環節動物門多毛綱，廣泛分布于我國河口和海灣生境，是一種棲息于水陸交錯帶的無脊椎動物[24－25]。沙蠶以沉積物中營養物質為主要食物，因其具有適應性強和耐污染等特點而受到海洋環境學家的廣泛關注[25]。許多沙蠶種類對污染暴露極為敏感，在污染環境中會產生各種生理應激反應，甚至死亡[26]。沙蠶對重金屬、石油烴等污染物有較強的敏感性[27]，因此，經常作為海陸交錯帶生態監測的指示生物。

本研究為探討新興有機和無機復合污染對海陸交錯帶關鍵性物種沙蠶的生態毒理學效應，采用微宇宙試驗方法，重點考察了雙齒圍沙蠶毒理學指標（致死率和AChE活性）與新興污染物（HHCB和納米TiO2）濃度間的關系，著重關注納米TiO2對于由HHCB所引起的沙蠶神經毒性的影響，以期為新興復合污染評價與預警提供數據及方法學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HHCB購于SIGMA－ALORICH公司，其分子式為C18H26O；納米TiO2購于國藥集團，分子式為TiO2，分子量為79.89，分子結構式為O=Ti=O，粒徑小于25 nm，純度為99.8%。AChE試劑盒購于南京建成生物工程研究所。供試動物雙齒圍沙蠶采自江蘇省贛榆縣沙蠶灘涂養殖場，為年齡、大小較為一致的成體沙蠶。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試生物采集及培養

采集的沙蠶置于有底泥的冰盒中運至實驗室，用采自其生活區域的海水清洗。挑選健康完整、大小相近的10條置于29 cm×14 cm×20 cm的養殖反應器中，加入1000 mL鹽度為3.2%的人造海水，在（15±1）℃恒溫培養2 d后，將健康沙蠶轉至含不同濃度污染物的人造海水中培養1周后，挑選健康的沙蠶個體分別進行毒性試驗。容器中投入不同濃度的HHCB和納米TiO2，利用超聲使其分散均勻。每一容器中投入10只沙蠶，每個處理組3個平行，觀察沙蠶受脅迫癥狀，并記錄死亡數目。為了消除干擾因素，減少實驗誤差，實驗過程中使用的玻璃容器均在實驗前用稀硝酸浸泡[28]。期間利用曝氣裝置保證氧氣恒定，不投喂餌料。人造海水成分見文獻[29]。

1.2.2 微宇宙試驗設計

根據預實驗結果，設定污染物脅迫濃度。單一脅迫組：HHCB 濃度為 0、150、450、750、1500 mg·L－1；納米 TiO2濃度為 0、5、10、40、80、160 mg·L－1。復合脅迫組：HHCB 濃度為 150 mg·L－1和 750 mg·L－1；納米 TiO2濃度為 5 mg·L－1和 40 mg·L－1。以不加污染物組為對照，投放沙蠶前利用超聲技術使化學品分散，分別取暴露 0、1、2、4、6 d 后沙蠶活體樣品進行 AChE 活性測定。

1.2.3 AChE活性測定

AChE活性測定參照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒方法操作。將待測沙蠶在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，稱重。用手術剪快速剪碎組織至勻漿管中，加入9倍體積預冷勻漿介質（0.01 mol·L－1Tris－HCl、0.0001mol·L－1EDTA－Na2、0.01 mol·L－1蔗糖、0.8%氯化鈉、pH 7.4緩沖液），采用組織勻漿器（Tissue Tearor，Biospec，US）冰浴勻漿 5 min。將制備好的勻漿液用高速冷凍離心機以4℃、8000 r·min－1條件離心10 min，留取上清液。按照試劑盒步驟依次加入試劑，于紫外－可見分光光度計412 nm處測定吸光值。定義每毫克組織蛋白在37℃保溫6 min，水解反應體系中1 μmol基質為1個活力單位（U），計算公式：

1.3 數據處理

數據以平均數±標準差（Mean±SD）表示，采用SPSS 23.0統計軟件進行單因素方差分析（One－way ANOVA），最小顯著差異法（LSD）在 α=0.05和 0.01水平進行差異顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 HHCB和納米TiO2單一及復合脅迫對沙蠶的毒性效應

沙蠶在受到HHCB和納米TiO2單一及復合脅迫后，均出現明顯的中毒癥狀，對照組沙蠶較為安靜，靜臥水底并表現鉆沙行為。處理組沙蠶表現出活動行為異常，對人為干擾反應靈敏，置于脅迫環境暴露1～2 d后，普遍出現抱團現象，無鉆沙行為，且腹部朝上；暴露4～6 d后，出現明顯的卷曲現象，身體開始出現大量紅腫充血、僵硬彎曲、生理排泄以及尾部潰爛，直至死亡等癥狀。這表明在本試驗處理濃度下，外界化學品對沙蠶產生較強的毒性效應，沙蠶為緩解中毒癥狀需要耗費自身能量儲備，并通過自溶身體肌肉組織等方式來補充解毒所需能量。相似的這種自溶現象也發生在暴露于石油烴污染條件下的沙蠶[30]以及暴露于污染條件下的蚯蚓[31-32]。這是環節動物門生物對于外界脅迫的一種特有的生理反應。

由圖1可知，HHCB單一脅迫8 d，當其濃度達到150 mg·L-1時，沙蠶死亡率為35.56%，隨著HHCB脅迫濃度的不斷增加，沙蠶死亡率逐漸升高，當濃度達到750、1500 mg·L-1時，沙蠶死亡率分別為95.56%和100%。由圖2可知，納米TiO2單一脅迫8 d，當其濃度從 5 mg·L-1增加到 40 mg·L-1時，沙蠶死亡率由13.33%迅速增加到66.67%；當脅迫濃度繼續增大時，曲線成“凸”型，死亡率增加趨于平緩，當脅迫濃度達到160 mg·L-1時，沙蠶的死亡率達到100%。通過擬合不同曲線方程發現，Logistic回歸——這種經常應用于藥理學和流行病學的回歸分析能夠很好地反映沙蠶死亡率與污染物濃度間的劑量-效應關系[30]，其回歸方程分別表示為：

圖1 不同濃度HHCB對沙蠶的毒性效應（8 d）Figure 1 Toxic effects of different concentrations of HHCB to P.aibuhitensis under 8 d stressed exposure

圖2 不同濃度納米TiO2對沙蠶的毒性效應（8 d）Figure 2 Toxic effects of different concentrations of nano-TiO2to P.aibuhitensis under 8 d stressed exposure

Y1=100-95.56/[1+（X1/323.08）3]

Y2=100-96.67/[1+（X2/27.72）3]

式中：X1表示 HHCB 脅迫濃度，mg·L-1；X2表示納米TiO2脅迫濃度，mg·L-1；Y1和 Y2分別表示 HHCB 和納米TiO2脅迫8 d條件下沙蠶的死亡率。通過擬合方程計算得到沙蠶可以耐受HHCB的半致死濃度（LC50）為 313.21 mg·L-1；納米 TiO2的 LC50為 27.09 mg·L-1。

根據上述半致死濃度各選擇高低兩個濃度進行復合脅迫試驗，2 d后沙蠶的毒性效應結果如圖3所示。納米TiO2的添加導致低濃度HHCB（150 mg·L-1）處理組沙蠶的死亡率明顯升高，從單一脅迫的20%增加至40%～80%；而納米TiO2存在與否對于高濃度HHCB（750 mg·L-1）所導致的死亡率（100%）均影響不大。分析其原因，可能與納米金屬顆粒結構的特殊性有關，納米TiO2的小尺寸效應使其能夠迅速進入生物體各個組織器官并與體內大分子發生反應，抑制相關蛋白或酶的活性，進而加重HHCB對生物體細胞外排機制的影響[4-5]，使得沙蠶體內大量蓄積污染物，對機體造成嚴重損傷，最終導致死亡。此外，納米金屬顆粒的表面及界面效應也可能使其與HHCB結合后發生一系列反應，導致團聚體化學特性改變，化學毒性大大增強，最終破壞生物體免疫系統，直至死亡。

2.2 HHCB單一脅迫對沙蠶體內AChE活性的影響

圖3 HHCB和納米TiO2復合脅迫對沙蠶的毒性效應（2 d）Figure 3 Joint toxic effects of HHCB and nano-TiO2to P.aibuhitensis under 2 d stressed exposure

圖4 不同暴露時間沙蠶體內AChE活性與HHCB暴露濃度的關系Figure 4 Relationships between AChE activity in P.aibuhitensis and the exposed concentrations of HHCB under different treatment time

圖5 不同暴露時間沙蠶體內AChE抑制率與HHCB暴露濃度的關系Figure 5 Relationships between inhibition rate of AChE in P.aibuhitensis and the exposed concentrations of HHCB under different treatment time

為探究HHCB對沙蠶所產生的神經毒性效應，考察了單一HHCB脅迫條件下沙蠶體內AChE活性及抑制率的變化。由圖4可見，不同暴露時間下AChE活性基本隨暴露濃度的增加而降低，即HHCB對沙蠶體內AChE的抑制率隨之升高（圖5）。與對照組相比，暴露1 d和2 d的抑制效應并不明顯，抑制率僅在 16.08%～38.81%（1 d）和 0.64%～19.30%（2 d）范圍內，HHCB的毒害抑制率均未超過50%；隨著HHCB對沙蠶脅迫時間的延長，抑制率明顯增高，特別是4 d時抑制率已達到了27.98%～53.62%，這表明沙蠶體內的AChE已被明顯抑制。從整個脅迫周期來看，沙蠶體內AChE對于HHCB毒害作用的反應比較靈敏，其活性的高低與HHCB暴露濃度基本呈線性負相關。這與HHCB具有酮類的三環結構密不可分，這種結構能夠導致該類化合物表現出天然麝香的氣味[33]，可對神經系統產生刺激作用，甚至毒害。有研究顯示，HHCB能夠影響大鼠小腦顆粒神經元（CGNs）細胞存活率，損傷細胞膜，引起氧化脅迫，誘導細胞凋亡，進而產生神經毒性效應，但它作用于神經遞質并產生毒害效應的具體機制還有待于進一步探究[34]。

2.3 HHCB和納米TiO2復合脅迫對沙蠶體內AChE活性的影響

HHCB和納米TiO2復合脅迫暴露1、2 d對沙蠶體內AChE活性的影響如圖6所示。在低濃度HHCB（150 mg·L－1）處理組中，納米 TiO2的存在對沙蠶體內AChE活性的影響顯著（P＜0.05），且隨納米TiO2濃度的增加，沙蠶體內AChE活性呈升高趨勢；與單一低濃度HHCB處理組相比，低濃度納米TiO2（5 mg·L－1）的存在顯著降低了AChE活性（P＜0.05），高濃度納米TiO2（40 mg·L－1）影響不顯著（P＞0.05）。在高濃度HHCB（750 mg·L－1）處理組中，1 d 時低濃度納米 TiO2的存在顯著促進了AChE活性（P＜0.05），而高濃度納米 TiO2影響不顯著（P＞0.05）；2 d 時納米 TiO2的存在顯著降低了AChE的活性（P＜0.05）。這表明脅迫初期納米TiO2的存在對HHCB神經毒性產生的作用受脅迫濃度和作用時間影響；當進入脅迫穩定期納米TiO2的存在可以鈍化AChE對HHCB的敏感性，進而抑制了酶活性。這可能是由納米TiO2自身的結構及化學特征所決定，HHCB與其復合后發生一系列反應，增強了對沙蠶的神經毒性效應，使其體內神經傳遞受到阻斷，導致沙蠶機體生理生化過程失調和破壞，進而造成免疫系統紊亂，直至死亡。

圖6 不同暴露時間HHCB和納米TiO2復合脅迫對沙蠶體內AChE活性的影響Figure 6 Effects of the joint stresses of HHCB and nano-TiO2on AChE activity in P.aibuhitensis under different treatment time

3 討論

目前以沙蠶作為模式生物進行的一些生態毒性效應研究多集中在重金屬污染脅迫下沙蠶的解毒機制及富集狀況方面[35-36]。關于HHCB對海洋生物的毒性效應研究亦有報道，研究發現，HHCB對海洋橈足類動物的幼體發育有損傷和抑制作用[6，37]。此外，多環麝香會影響機體對污染物的外排機制，抑制外排轉運體活性，導致污染物在體內積累，毒性增強，最終導致機體死亡[38]。本研究結果表明，沙蠶對HHCB和納米TiO2具有較強的敏感性，隨著污染物濃度的增加，沙蠶的死亡率呈上升趨勢；HHCB的脅迫可顯著抑制沙蠶體內AChE活性，是一種可作用于神經系統并產生神經毒性的化學物質。它通過引起乙酰膽堿酯在中樞膽堿能突觸、神經肌肉接頭等處的積累，表現出病狀，造成生物體生理生化過程的失調與破壞，從而導致生物體死亡。本研究中，在HHCB脅迫下沙蠶體內AChE活性出現與對照組相當或升高的現象可能是由于HHCB激發了沙蠶體內AChE的從頭合成，進而出現了酶活性升高的現象，這一結果與有機磷農藥抑制AChE研究中酶活性的變化結論相一致[39]。Pérez等[20]研究表明，污染地區的過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽轉移酶（GST）活性增強，分別為對照組的7倍和2倍，而AChE活性受到抑制，僅為對照組的四分之一，由此證明該地區存在具有神經毒性和氧化應激誘導的化學污染物；AChE在兩種供試生物中均表現出了相同的趨勢，由此認為AChE是這些被測試指標中最為可靠且敏感的生物標志物。本實驗研究結果也表明，隨著HHCB濃度的升高和暴露時間的增加，沙蠶體內AChE的活性顯著降低。這一結論與Pérez等的研究結果基本一致，可能是由于HHCB與AChE發生乙酰化作用，從而抑制AChE活性，乙酰膽堿無法被水解，在體內大量蓄積，誘發神經纖維長期處于興奮狀態，過度刺激神經沖動傳導，導致中樞神經系統癱瘓[40]。因此，對HHCB而言，AChE是一種反應靈敏的生物標志物。

自然環境中，由于污染物來源的多樣性和復雜性，通常情況下都是多種污染物共存形成復合污染。單個污染物在水體中的行為不可避免地受制于其他共存污染物。目前，針對重金屬與有機物聯合對生物的毒性作用研究相對較多。例如：張玄可等[41]研究表明Cd暴露對南方鲇的膽堿酯酶活性有較強的抑制作用。Zhang等[30]研究重金屬與石油烴的復合污染對沙蠶AChE活性的影響表明，特定濃度的重金屬可以緩解石油烴的神經毒性，這一結論與本研究結果稍有差異，這可能與化學品種類、其在生物體內的代謝途徑和能否通過組織血液屏障的機制等有關[42]。此外，化學品間的濃度及組合關系，也是差異產生的另一個重要因素，這與聯合效應廣義理論基本一致。本研究結果表明，納米TiO2的存在有可能增強沙蠶AChE對HHCB的敏感性，進而加劇了HHCB對沙蠶的神經毒害作用，其可能的原因是：①由于納米TiO2的結構非常微小，可以輕松地通過細胞膜進入細胞內，同時改變細胞膜的滲透性，使得HHCB更易通過細胞膜進入細胞核內，進而導致明顯的細胞毒性及炎癥反應；②納米TiO2和HHCB的配位結合能夠抑制生物分子的活性，使得維持生物正常生理過程的功能受到破壞，從而導致毒性；③納米TiO2的高化學活性又使其可以與細胞內眾多細胞器以及一些生物大分子發生作用，同時對組織也有嚴重損傷作用[43]，進而影響機體對HHCB的外排機制，抑制外排轉運體活性，使得毒性較強的HHCB在沙蠶體內大量蓄積，對機體造成嚴重損傷，最終導致沙蠶快速死亡；④納米TiO2是一種典型的納米金屬氧化物，推測納米TiO2與HHCB結合時，其表面可能被HHCB分子所修飾，這些修飾后的顆粒在水中具有較好的分散性，從而防止其尺寸效應的損失，如果表面特性不能被有效控制，納米顆?？赡苎杆倬奂纱蟮念w粒，更容易與生物分子和器官作用，從而對沙蠶產生更強的毒性效應；⑤納米TiO2與HHCB復合污染情況下，兩者通過抑制核酸的生物合成和破壞蛋白質合成機制以及破壞動物組織膜的完整性等活動誘導沙蠶衰老直至死亡。

4 結論

（1）沙蠶體內AChE對HHCB的敏感性較高，HHCB能顯著抑制沙蠶體內AChE活性，對沙蠶的神經毒性作用較大。

（2）納米TiO2的存在可加重HHCB對生物體的神經毒性，與化學品間的濃度及組合關系密切相關。

（3）AChE是佳樂麝香的靶標酶類，可以通過酶活性的變化情況來表征目標區域的污染狀況，可作為該類化學品的潛在生物標志物。

（4）新型環境修復材料，如納米TiO2在處理有機污染時需摸清使用量及組合方式，慎重考量其可能帶來的復合污染毒性效應。

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