蜂膠復(fù)方產(chǎn)品對(duì)心肌肥厚改善機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

孫燕如 - 韓鳴鳳 - 沈圳煌 - 吳珍紅2, -2, 繆曉青2, -2,

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3. 天然生物毒素國(guó)家與地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

高血壓是世界范圍內(nèi)致死率最高的單因素疾病，會(huì)累及心臟、大腦、腎臟等靶器官[1]。由高血壓引起的左心室重構(gòu)是導(dǎo)致心臟衰竭、猝死和心肌梗死的一個(gè)獨(dú)立原因[2]。當(dāng)心肌負(fù)荷增高時(shí)，心肌代償性改變，出現(xiàn)左心室的肥大，最終心肌的不適應(yīng)性變化發(fā)生，導(dǎo)致心肌重構(gòu)從而引發(fā)心臟衰竭。高血壓心肌肥厚與重構(gòu)過(guò)程中，心肌細(xì)胞壞死、凋亡、自噬，同時(shí)，纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的重組會(huì)引起心肌纖維化[3]。左心室重構(gòu)通常表現(xiàn)為心室壁增厚、心肌重量增加和心肌重塑[4]。目前，病理性心肌肥厚的分子機(jī)制尚未完全闡明，普遍認(rèn)為當(dāng)心臟受到機(jī)械牽張、壓力負(fù)荷、缺血缺氧等刺激時(shí)，多個(gè)信號(hào)通路共同參與到心肌肥厚中，其中胰島素信號(hào)通路是介導(dǎo)病理性心肌肥厚的主要通路[5]，在胰島素與胰島素受體結(jié)合后，活化的胰島素受體基質(zhì)與多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白相互影響，繼而激活了PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。研究顯示，胰島素受體通路上的基因ERK[6-7]、PI3K、GSK3β[8-9]等都可能是改善心肌肥厚的作用靶點(diǎn)。

用蜂膠、蜂王漿、蜂巢提取液等藥食兩用的蜂產(chǎn)品與蜂毒按照中藥“君臣佐使”的配伍原則可復(fù)配制成一種蜂膠復(fù)方產(chǎn)品。前期試驗(yàn)[10]證明，在離體蛙心上，該蜂膠復(fù)方產(chǎn)品可以增加蛙心收縮力從而改善心臟功能，其正性肌力類似于腎上腺素、可被鹽酸普萘洛爾抑制。在慢性心衰大鼠模型上，這一產(chǎn)品可以阻止慢性心衰進(jìn)程且效果優(yōu)于臨床藥物右雷佐生[11]。此外，筆者在臨床使用中也發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品有降壓的功效，但其機(jī)制尚不明確。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)常用于高血壓的病理、藥理研究，其發(fā)病進(jìn)程類似于人類的原發(fā)性高血壓[12-13]。因此，考慮選用SHR為高血壓大鼠模型，探究該產(chǎn)品對(duì)高血壓引起的心肌肥厚的改善效果及可能的機(jī)制。

本研究擬采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，考察蜂膠復(fù)方產(chǎn)品對(duì)SHR大鼠心肌基因轉(zhuǎn)錄組水平上的差異變化，結(jié)合GO分析和KEGG通路分析，找到差異基因富集的主要代謝通路，為該蜂膠復(fù)方產(chǎn)品對(duì)SHR心肌肥厚的改善作用找到相應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蜂毒：意大利蜜蜂蜂毒，福建省神蜂科技開(kāi)發(fā)有限公司；

蜂膠：意大利蜜蜂采集自楊樹的蜂膠，福建省神蜂科技開(kāi)發(fā)有限公司；

蜂王漿：油菜漿，福建省神蜂科技開(kāi)發(fā)有限公司；

吐溫-80：分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

乙醇、羧甲基纖維素鈉：化學(xué)純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

RNA提取試劑盒：TransZol?Up型，北京全式金生物技術(shù)有限公司；

反轉(zhuǎn)錄試劑盒：TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Kit型，寶生物工程(大連)有限公司；

熒光定量試劑盒：SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)Kit型，寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR儀：720 Thermal Cycler型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)：CFX384型，美國(guó)BioRad公司；

測(cè)序平臺(tái)：Hiseq 2500型，美國(guó)Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 蜂膠復(fù)方產(chǎn)品的配制

(1) 蜂膠醇提物制備：使用80%乙醇按料液比1∶4 (g/mL)對(duì)意大利蜜蜂采集的楊樹蜂膠浸提，浸提程序?yàn)椋?0 kHz 超聲預(yù)處理20 min，60 ℃浸提5 h，室溫浸提2 d；對(duì)浸提液真空抽濾后，濾液在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，除蠟操作后55 ℃下真空干燥至恒重，測(cè)定總黃酮含量為(302.16±2.33) mg/g。

(2) 蜂王漿醇提物制備：在40 ℃下使用95%乙醇按料液比1∶4 (g/mL)對(duì)油菜漿提取3 h，4 000×g離心20 min后，獲得上清、對(duì)沉淀物繼續(xù)按上述方法提取2次，最后合并濾液，65 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到蜂王漿醇提物后冷凍干燥備用，測(cè)得蜂王漿醇提物中10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)含量為(21.06±0.32)%。

(3) 蜂巢水提物制備：取意大利蜜蜂陳舊巢脾(使用3年)磨碎，按照料液比1∶5 (g/mL)加水煮沸1 h，過(guò)濾后濾渣繼續(xù)按上述方法處理2次，最終合并3次濾液，除蠟、濃縮、干燥至恒重。

(4) 蜂毒肽的制備：粗蜂毒溶于水后5 000 r/min離心15 min，取上清、冷凍干燥。采用葡聚糖凝膠柱層析法分離蜂毒，以0.1 mol/L 甲酸和甲酸銨緩沖液進(jìn)行G25柱層析，對(duì)其中溶血活性較強(qiáng)的組分再進(jìn)行G50柱層析，接著以0.02 mol/L 甲酸和甲酸銨緩沖液對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行G75柱層析，獲得電泳純級(jí)的終產(chǎn)物。

(5) 蜂膠復(fù)方產(chǎn)品的制備：蜂膠醇提物與蜂巢水提物按1∶1質(zhì)量比混合，加入2%吐溫-80后，添加蜂毒肽使得最終的產(chǎn)品中蜂毒肽含量為0.12%，接著加入與蜂膠醇提物質(zhì)量相等的蜂王漿醇提物。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 40只自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，體重180～220 g，雄性，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2011-0011。將40只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(MC)、蜂膠復(fù)方產(chǎn)品低、中、高劑量組(分別為BYL-L、BYL-M、BYL-H)。按照“人與大鼠體表面積比”換算給藥劑量，見(jiàn)式(1)。蜂膠復(fù)方產(chǎn)品低、中、高劑量分別是臨床使用劑量的1，2，4倍，換算成大鼠給藥量分別約為0.5，1.0，2.0 g/kg。

(1)

式中：

c——大鼠給藥量，g/kg；

m——人給藥量，g/kg。

1.2.3 心臟樣本處理 各組大鼠給予相應(yīng)藥物5周，于末次給藥后斷食不斷水繼續(xù)飼養(yǎng)24 h，處死后剖取心臟，稱得心臟和左心室質(zhì)量后投入液氮，-80 ℃保存。通過(guò)SPSS v19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從蜂膠復(fù)方產(chǎn)品灌胃組中篩選出與MC組差異最大的試驗(yàn)組，進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

1.2.4 心肌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與結(jié)果分析

(1) RNA樣品制備與測(cè)序：待測(cè)組分別選取3只大鼠心臟樣本進(jìn)行RNA提取，富集mRNA，加入fragmentation buffer使其成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過(guò)QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。構(gòu)建好的文庫(kù)用HiSeqTM2500型測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

(2) 差異基因的篩選：在信息分析前對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，通過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾來(lái)減少數(shù)據(jù)噪音。將組裝的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)與參考文件基因組進(jìn)行比對(duì)分析，基因表達(dá)量的計(jì)算使用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)法利用FDR與log2FC來(lái)篩選組間差異基因，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1。接著對(duì)差異基因進(jìn)行功能富集分析與KEGG代謝通路分析。

(3) 功能富集及KEGG代謝通路分析：將差異表達(dá)基因向Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)的各term映射，并計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)，然后用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比、在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。將DEGs注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)信息對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG通路注釋。

(4) qPCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的驗(yàn)證：從DEGs中隨機(jī)挑選9個(gè)基因，通過(guò)qPCR結(jié)果來(lái)驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果的可靠性。基因引物由廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。RNA提取方法如前所述，接著，根據(jù)說(shuō)明書操作，使用PrimeScript RT reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。接著，用SYBR染料法在Step One Plus Real-Time PCR System 上完成qPCR操作。以GADPH為內(nèi)參基因，使用2-△△ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂膠復(fù)方對(duì)SHR左心室指數(shù)的影響

給藥5周后，各組大鼠的心臟指數(shù)與左心室指數(shù)見(jiàn)表1，與MC組相比，BYL-H組的左心室指數(shù)有顯著差異(P<0.05)，而其他幾個(gè)給藥組雖然在左心室指數(shù)和心臟指數(shù)上有不同程度的減輕，但均無(wú)顯著差異(P>0.05)。因此，分別從MC組和BYL-H組中隨機(jī)選取3只大鼠的心臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.2 Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與評(píng)估

對(duì)MC組和BYL-H組樣本Illumina測(cè)序，過(guò)濾后獲得的有效讀段均在95.82%以上，兩端Q30在89.5%以上，過(guò)濾后的數(shù)據(jù)有88.42%以上能比對(duì)到參考基因組上(表2)，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

2.3 DEGs的GO分析

與MC組相比，從BYL-H組篩選出1 297個(gè)DEGs，其中91個(gè)DEGs上調(diào)、1 206個(gè)DEGs下調(diào)。對(duì)所有DEGs進(jìn)行GO注釋，包括分子功能、細(xì)胞組分、生物過(guò)程三類。在生物過(guò)程中，注釋到發(fā)育進(jìn)程(developmental process)、生物黏附(biologicaladhesion)、運(yùn)動(dòng)(locomotion)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生(cellular component organization or biogenesis)、定位(localization)、代謝進(jìn)程(metabolicprocess)、單一機(jī)體進(jìn)程(single-organismprocess)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)、生長(zhǎng)(growth)、免疫進(jìn)程(immune system process)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)、信號(hào)傳遞(signaling)、生殖(reproduction)、多種機(jī)體進(jìn)程(multi-organism process)、行為(behavior)、多細(xì)胞生物過(guò)程(multicellularorganismalprocess)的DEGs數(shù)目分別為410，116，138，351，346，593，720，444，886，69，147，469，403，84，34，1，152(圖1)。

表1蜂膠復(fù)方產(chǎn)品對(duì)SHR心臟指數(shù)與

左心室指數(shù)的影響?

Table 1 Effect of the propolis product on heeart index and left ventricular index in SHRs (n=10)

組別左心室指數(shù)組別左心室指數(shù)MC0.280±0.015BYL-M0.276±0.014BYL-L0.280±0.010BYL-H0.267±0.013*

? *表示與模型組相比，P<0.05。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)分析Table 2 Analysis of transcriptome sequencing data

1. 行為 2. 生物黏附 3. 生物調(diào)節(jié) 4. 細(xì)胞成分組織或生物起源 5. 細(xì)胞進(jìn)程 7. 生長(zhǎng) 8. 免疫進(jìn)程 9. 定位 10. 運(yùn)動(dòng) 11. 代謝過(guò)程 12. 多種機(jī)體進(jìn)程 13. 多細(xì)胞生物過(guò)程 14. 生殖 15. 應(yīng)激反應(yīng) 16. 信號(hào)傳遞 17. 單一機(jī)體進(jìn)程 18. 細(xì)胞 19. 細(xì)胞連接 20. 細(xì)胞組件 21. 細(xì)胞外基質(zhì) 22. 細(xì)胞外基質(zhì)成分 23. 胞外區(qū) 24. 細(xì)胞外區(qū)域部分 25. 離子配合物 26. 細(xì)胞膜 27. 細(xì)胞膜零件 28. 細(xì)胞膜內(nèi)腔 29. 細(xì)胞器 30. 細(xì)胞器零件 31. 突觸 32. 突觸零件 33. 結(jié)合 34. 催化活性 35. 分子傳感器活性 36. 分子功能調(diào)節(jié)器 37. 核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 38. 信號(hào)傳感器活性 39. 結(jié)構(gòu)分子活性 40. 轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白質(zhì)結(jié)合 41. 轉(zhuǎn)運(yùn)活性

圖1 GO term分類結(jié)果

Figure 1 Results of GO term classification

2.4 DEGs的KEGG富集分析

不同基因之間相互協(xié)調(diào)，方得以行使生物學(xué)功能，基于pathway的分析有助于更進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能。對(duì)所有DEGs進(jìn)行KEGG富集，共有410個(gè)DEGs(24個(gè)上調(diào)、386個(gè)下調(diào))可富集到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，說(shuō)明給予蜂膠復(fù)方產(chǎn)品后引起了多個(gè)代謝通路的變化，圖2列出了差異最顯著的前20個(gè)pathway。在前10個(gè)pathway中，富集到黏著斑、胰島素信號(hào)通路、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)通路-多個(gè)物種、長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)通路-哺乳動(dòng)物、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、唾液分泌、背腹軸形成、MAPK信號(hào)通路的DEGs數(shù)目分別為36，24，15，18，17，39，28，14，8，31，提示該蜂膠復(fù)方產(chǎn)品可能在炎癥反應(yīng)、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面對(duì)SHR心肌產(chǎn)生影響。有趣的是，DEGs富集較多的3個(gè)代謝通路——PI3K-Akt信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路是介導(dǎo)病理性心肌肥厚的主要通路[5]。PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK通路是胰島素和胰島素受體結(jié)合后，經(jīng)不同信號(hào)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)而激活的兩個(gè)主要通路，與胰島素信號(hào)通路密切相關(guān)，提示蜂膠復(fù)方產(chǎn)品可能通過(guò)影響胰島素相關(guān)信號(hào)通路而改善SHR心肌肥厚。

圖2 差異基因富集顯著的前20個(gè)KEGG富集圖Figure 2 Top 20 KEGG enriched graph with significant DEGs

2.5 胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因的篩選

圖3是胰島素信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路重疊基因的韋恩圖。3個(gè)通路共同的DEGs是mitogen activated protein kinase 1 (MAPK1)；胰島素信號(hào)通路與PI3K-Akt通路共同的DEGs為：phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1(Pik3r1)、protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2 (Prkaa2)、insulin receptor substrate 1 (Irs1)、glycogen synthase kinase 3 beta (Gsk3b)、3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 (Pdpk1)、tuberous sclerosis 1(Tsc1)；胰島素信號(hào)通路與MAPK通路共同的DEGs為：crk-like protein-like、CRK proto-oncogene, adaptor protein (Crk)、protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta (Prkacb)。與MC組相比，以上各差異基因在BYL-H組中均為下調(diào)(表3)。

胰島素信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK通路共同的DEG為MAPK1，即ERK2。心肌肥厚的過(guò)程中，心臟的機(jī)械負(fù)荷增加，局部和系統(tǒng)的神經(jīng)體液因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子增加，機(jī)械和神經(jīng)內(nèi)分泌的效應(yīng)器通過(guò)伸展、G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶來(lái)誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)路的激活[14]。由于大多數(shù)刺激引起心肌肥厚的刺激，也會(huì)在ERK1和ERK2激酶激活環(huán)內(nèi)引發(fā)一種急性磷酸化作用，導(dǎo)致它們的激活，因此ERKs長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是心臟肥大的促進(jìn)劑[14]。在本試驗(yàn)中，BYL-H心肌的ERK2的表達(dá)量與MC組的相比，顯著降低，與異鉤藤堿[6]、法舒地爾[15]等降低ERK2mRNA表達(dá)量、改善心臟功能的結(jié)果一致。

胰島素和胰島素受體結(jié)合會(huì)導(dǎo)致胰島素受體底物(IRS)的酪氨酸磷酸化，激活的胰島素受體與IRS和其他蛋白相互作用，激活包括PI3K-Akt和MAPK通路在內(nèi)的多個(gè)通路。心臟中，IRS1和IRS2是表達(dá)量最高的IRS蛋白，對(duì)胰島素調(diào)控激活PI3K起重要作用[16]。PI3K由p110催化亞基和p85調(diào)控子單元組成，催化生成脂質(zhì)產(chǎn)物PIP3，進(jìn)而導(dǎo)致PDK1調(diào)控的Akt的激活。Akt通過(guò)磷酸化蛋白來(lái)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程，在心臟中表達(dá)最多的是Akt1和Akt2，前者主要調(diào)控體細(xì)胞生長(zhǎng)，后者主要與代謝相關(guān)。由Akt介導(dǎo)的磷酸化作用抑制了GSK3β活性，從而促進(jìn)了心臟肥大和糖原的合成；Akt介導(dǎo)調(diào)節(jié)的TSC1磷酸化可調(diào)控mTOR的激活，而mTOR激活后可促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。胰島素信號(hào)通路中，與IRS相互作用的其他轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白包括GRB2，GRB2是導(dǎo)致MAPK激活的SOR、RAS、RAF和MEK串聯(lián)的一部分，MAPK通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移中起著重要作用。在試驗(yàn)中，BYL-H組心臟樣本中的IRS1、PI3Kγ、GSKβ等胰島素信號(hào)通路與PI3K-Akt信號(hào)通路的重要基因的表達(dá)量相較于MC組明顯下降。PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。PI3K有多個(gè)亞型，其中PI3K-α和γ在心臟中表達(dá)、且發(fā)揮重要作用，抑制PI3K-γ可保護(hù)心衰時(shí)β1-AR下調(diào)而改善心肌功能[17]。GSK3β是多種重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶[18]。心肌肥大過(guò)程中，細(xì)胞外刺激信號(hào)激活了PI3K-Akt通路中的Akt，造成其下游GSK3β磷酸化、導(dǎo)致GSK3β的失活，進(jìn)而導(dǎo)致心肌肥大的發(fā)生。GSK3β在Tyr216位點(diǎn)磷酸化時(shí)，GSK3β活性增加，而在Ser9位點(diǎn)磷酸化時(shí)，GSK3β活性受到抑制，活化的GSK3β可以阻止心肌肥厚的發(fā)展[19]。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，當(dāng)灌胃蜂膠復(fù)方產(chǎn)品后，GSK3β在SHR心肌中的表達(dá)量下降了，但GSK3β的活性是否改變、如何改變需要進(jìn)一步研究。

3個(gè)KEGG通路分別是：Insulin，胰島素信號(hào)通路；PI3K-Akt，PI3K-Akt信號(hào)通路；MAPK，MAPK信號(hào)通路

圖3 DEGs富集數(shù)目最多的前3個(gè)KEGG通路中重疊的基因 Figure 3 Overlapping genes in the top 3 KEGG pathway表3 胰島素信號(hào)通路與PI3K-Akt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路的重疊DEGsTable 3 Overlapping DEGs of insulin signaling pathway with PI3K-Akt signaling pathway and/or MAPK pathway

2.6 qPCR驗(yàn)證結(jié)果

為證實(shí)RNA-Seq數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)挑選9個(gè)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。這9個(gè)基因分別是Gadd45g(Gene ID: 291005 )、MAPK1 (Gene ID: 116590)、Eif4g1 (Gent ID: 287986)、Otud1 (Gene ID: 498803 )、Clic4 (Gene ID: 83718)、Usmg5 (Gene ID: 103693430)、Mt-nd4 (Gene ID: 26201)、Mt-nd3 (Gene ID: 26199 )、Mt-atp6 (Gene ID:26197)。如圖4所示，經(jīng)qPCR驗(yàn)證，這些被選基因的相對(duì)定量表達(dá)模式與RNA-Seq測(cè)序結(jié)果一致，表明測(cè)序結(jié)果是可靠的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以SHR為受試動(dòng)物，通過(guò)左心室指數(shù)的計(jì)算確定蜂膠復(fù)方產(chǎn)品對(duì)心肌肥厚的干預(yù)效果，及藥效最佳劑量組(BYL-H組)。接著使用RNA-Seq技術(shù)對(duì)BYL-H組和MC組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出了1 297個(gè)DEGs，將這些DEGs進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)富集到與胰島素代謝相關(guān)的幾個(gè)通路(即胰島素信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路)上的DEGs數(shù)目較多，提示蜂膠復(fù)方產(chǎn)品可能通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素代謝通路改善SHR的心肌肥厚，而在胰島素信號(hào)通路上對(duì)ERK2、PI3K-γ等下調(diào)表達(dá)的效果可能是蜂膠復(fù)方產(chǎn)品作用到SHR心肌肥厚的靶點(diǎn)。

圖4 基因相對(duì)定量結(jié)果Figure 4 Relative gene expression levels of candidate genes. Data from qPCR and RNA-Seq both are means of three replicates

后續(xù)研究還可以從該蜂膠復(fù)方產(chǎn)品對(duì)ERK2、PI3K-γ等基因的磷酸化和非磷酸化蛋白的表達(dá)水平差異入手，對(duì)相關(guān)基因的激活或抑制情況作進(jìn)一步探究。

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