高效液相色譜法測定面粉中過氧化苯甲酰的含量

張 曼，劉簫音

（赤峰學院 化學化工學院，內蒙古 赤峰 024000）

1 前言

1.1 過氧化苯甲酰

過氧化苯甲酰，簡稱BPO或BP，白色粉末，無色，稍有些苦杏仁味，難溶于水，易溶于有機溶劑.因為過氧化苯甲酰具有強氧化作用，能夠被還原性物質還原成苯甲酸.苯甲酸能夠殺死面粉中的一些微生物，具有殺菌以及防霉作用.這種特質有益于面粉的長時間保存和貯藏.

1.2 過氧化苯甲酰與面粉

由于過氧化苯甲酰能夠有效地抑制面粉中微生物的繁殖成長，故過氧化苯甲酰具有提高面粉彈性，提升面粉等級的作用，從而改進面粉的品質.它分解生成的苯甲酸能與小麥胚乳中的類胡蘿卜素迅速反應，從而使面粉達到脫色、漂白的效果，所以面粉廠家通常將其作為面粉添加劑的首選.

過氧化苯甲酰(BPO)，是面粉廠家備受青睞的一種改進劑，可以使面粉達到增白、和面粉的貯藏性能得以提高的效果[1].研究表明，過多的過氧化苯甲酰攝取到人體，短時間可使人呈現惡心、頭暈、神經衰弱等中毒現象，長時間食用會對肝臟形成首要的危害.且過量添加會使其顏色發青，同時破壞面粉中的維生素，降低面筋質量，嚴重影響食品衛生指標和食用品質[2].因此，為了人們的身體健康，嚴格控制其添加量是十分必要的.各國都規定了使用限量.而我國的規定安全使用限量是0.06g/kg[3].按照標準，并出于安全及性能的考慮，人們對面粉中過氧化苯甲酰含量的測定越來越重視，測定的方式越來越多.

1.3 面粉中過氧化苯甲酰含量的測定方法

目前，測定過氧化苯甲酰的含量的方法主要有：高效液相法、氣相色譜法、電化學法、分光光度法、化學發光法、熒光光度法等.[4]

1.3.1 氣相色譜法

氣相色譜法是還原性鐵粉和鹽酸與過氧化苯甲酰反應，該還原反應將過氧化苯甲酰還原后生成苯甲酸，經加入石油醚-乙醚有機混合溶液提取苯甲酸后，經氣相色譜儀測定后，與做出的標準系列進行比較定量，從而通過計算，將苯甲酸的含量換算成為過氧化苯甲酰的含量[5].此法靈敏度高，但是操作耗時煩瑣，對儀器設備條件要求高.

1.3.2 熒光光度法

裴翠錦[6]的方法是在中性或弱酸性溶液中，在氨存在下，苯胺和過氧化苯甲酰可以生成強熒光物質，而過氧化苯甲酰能夠對這種強熒光物質產生抑制作用.根據圖譜中呈現的過氧化苯甲酰對該種熒光物質的抑制作用的程度從而來確定被測物質中的過氧化苯甲酰含量的多少.但該方法對操作過程中各條件要求較為苛刻，不易于得到理想的精確結果.

1.3.3 分光光度法

由于過氧化苯甲酰具有強氧化性，能夠使一些物質被氧化，利用這些物質自身帶有顯色反應或者與其他物質能夠產生顯色反應，經分光光度計測定，計算從而得出過氧化苯甲酰的含量.這種方法不需要提取和分離，操作簡便快速.徐競[7]利用過氧化苯甲酰與碘化鉀反應后可以產生苯甲酸和碘，然后通過淀粉溶液的加入，能夠使得溶液的顏色變藍.過氧化苯甲酰的最大吸收波長在585nm處，且與過氧化苯甲酰濃度在指定的檢測范圍內能夠呈現精準的線性關系.

1.3.4 化學發光法

Wada等人發現：在紫外光的照射下，過氧化苯甲酰可以轉變為H2O2.并且根據過氧草酸酯發生的化學發光反應，創立了一種過氧化苯甲酰含量測定的新方法.但是該方法需要經過高效液相色譜來進行分離幾種氧化物.過程比較煩瑣，對設備要求也高.

1.3.5 電化學法

選用萃取劑-二氯甲烷，底液-二氯甲烷和乙酸按比例混合，支撐電解質-四丁基高氯酸銨；選用工作電極-玻璃電極，方法-視差脈沖安伏法來進行過氧化苯甲酰含量的測定.雖然此方法相對比較簡單，然而，用到的氯仿以及二氯甲烷均疑可能為致癌物，而且氯仿在見光的情況下會逐步地分解成劇毒的氯化氫和光氣，這兩種物質對人體的危害相當的大.

1.3.6 高效液相法

氣相色譜這種分析技術是在二十世紀五十年代出現的，這種高效分析技術包括分離和分析雙重科技.1903年，首次提出色譜法和色譜圖的是德國植物化學家茨維特.然而把化學鍵合固定相和高壓泵融入液相色譜就形成了HPLC是在60年代的后期.1970年中期之后，液相色譜融入了微處理機的技術，它的融入進一步使儀器的分析精度和自動化水平得到擢升.

高效液相色譜是由“高壓輸液泵”“色譜柱”“進樣器”“檢測器”“餾分收集器”以及“數據獲取”和“處理系統”等部分構成的.色譜法的一個重要延伸及運用就是高效液相，它的流動相為液體，并且輸液系統采用高壓程序，將具備不同比例的復雜溶劑和不同極性的簡單溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，各組分在柱內被分離后，進入到檢測器后進行檢測，從而實現對試樣的分析.試樣進來檢測器，用紀錄儀紀錄色譜圖，根據色譜圖上出現的物質成分的峰面積、峰高或峰寬對濃度作標準曲線而進行定量分析.

1.4 高效液相色譜法的原理及應用

高效液相色譜法測定過氧化苯甲酰含量的原理：被檢測樣品在通過有機溶劑的提取后，使過氧化苯甲酰經還原劑還原成為苯甲酸，然后經過高效液相色譜的測定，再與實驗的標準系列（過氧化苯甲酰或苯甲酸）的結果來進行計算并定量.[8]這種方法具有高壓、高效、高靈敏度，分析速度快等特點.該方法被延伸運用于醫學和生物以及化學等各個先進的科研領域.

本論文涉及的操作全部過程：面粉中的過氧化苯甲酰先經甲醇溶解，后采用超聲震蕩的方式，以確保面粉中的過氧化苯甲酰經甲醇已經完全地分解為苯甲酸，最后再經過離心機的高效離心，取經過濾膜后的上清液，直接通過高效液相色譜檢測器進行檢測.記錄各樣品溶液的保留時間與峰面積的值.對比過氧化苯甲酰系列標準溶液做出的標準曲線，從而確定被測面粉中過氧化苯甲酰的含量.

2 實驗部分

2.1 實驗儀器

高效液相色譜儀：Agilent Technologies 1260 Infinity型；

電子天平：TP-214型（北京賽多利斯儀器系統公司）；

離心機；離心管；

超聲波清洗器：SB25—12DT型（寧波新芝生物科技股份有限公司）；

0.45μm的過濾膜；

50mL容量瓶六個；100mL容量瓶一個；5mL吸量管一支；洗耳球一個；保鮮膜若干；稱量紙.

2.2 實驗藥品

表1 實驗藥品規格表

實驗面粉為內蒙古赤峰市紅山區西南地村糧油店散裝面粉；

實驗中用水均為杭州娃哈哈集團生產的“娃哈哈”純凈水；所有溶劑和溶液在分析前都已經過0.45μm的過濾膜進行過濾.

2.3 標準溶液的配制

2.3.1 過氧化苯甲酰操作液的配制

10μg/mL的標準溶液：用電子天平準確稱取0.1000g標準BPO于100mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲震蕩1min，帶固體全部溶解后，用甲醇定容到刻度，搖勻，定容.備用.

2.3.2 過氧化苯甲酰標準溶液的配制

配置不同濃度的過氧化苯甲酰的系列溶液：用移液管分別準確地移取上述10μg/mL的BPO標準溶液5mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL 至 6 個 50mL 的容量瓶中，用甲醇定容，得到 1、2、4、6、8、10μg/mL 的標準系列溶液.分別標號為1～6號.各標準溶液濃度見如下表2.

表2 過氧化苯甲酰系列標準溶液的濃度

2.4 色譜條件的選擇

2.4.1 檢測波長的選擇

在進樣量為5μL，壓強為280kpa，流速為2.0mL/min的色譜條件下，分別測定BPO在230nm、235nm、240nm各個波長處的峰面積.不同波長下溶液的色譜圖如下圖1～3所示，不同波長下溶液的定性分析數據如下表3～5所示.

圖1 檢測波長為230nm標準溶液的色譜圖

表3 檢測波長為230nm標準溶液的定性分析數據

圖2 檢測波長為235nm標準溶液的色譜圖

表4 檢測波長為235nm標準溶液的定性分析數據

圖3 檢測波長為240nm標準溶液的色譜圖

表5 檢測波長為240nm標準溶液的定性分析數據

2.4.2 流速的選擇

在進樣量為5μL，壓強為280kpa，檢測波長為235nm的色譜條件下，分別測定了BPO在1.0mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min各個流速下的峰面積.不同流速下溶液的色譜圖如下圖4～6所示，不同波長下溶液的定性分析數據如下表6～8所示.

圖4 流速為1.0mL/min標準溶液的色譜圖

表6 流速為1.0mL/min標準溶液的定性分析數據

圖5 流速為1.5mL/min標準溶液的色譜圖

表7 流速為1.5mL/min標準溶液的定性分析數據

圖6 流速為2.0mL/min標準溶液的色譜圖

表7 流速為2.0mL/min標準溶液的定性分析數據

2.4.3 面粉樣品溶液的配制

用電子天平準確稱取面粉樣品1.0000g于潔凈的離心管中，準確加入10.00mL甲醇，用保鮮膜密封后，室溫下超聲震蕩30min，然后放入離心機，在2000r/min的轉速下離心15min.取上清液約5mL，用0.45μm的過濾膜過濾.

2.5 高效液相色譜的測定

2.5.1 高效液相色譜對過氧化苯甲酰標準溶液的測定

取1號到6號過氧化苯甲酰標準溶液，分別放入小樣品瓶中，對應放入各樣品瓶槽中，自動進樣5μL進入高效液相色譜儀中，在上述選擇高效液相色譜條件最佳情況下，對不同濃度的過氧化苯甲酰標準溶液進行測定，標準液圖譜如下圖7.

圖7 過氧化苯甲酰標準液的高效液相色譜圖

表8 標準曲線數據

2.5.2 高效液相色譜對面粉樣品中過氧化苯甲酰的測定

將樣品放入樣品瓶中，放入樣品槽，自動進樣5μL進入高效液相色譜儀中，在上述選擇高效液相色譜條件最佳情況下，對樣品溶液進行測定，樣品液圖譜如下圖8.

圖8 面粉樣品液的高效液相色譜圖

表9 面粉樣品液的定性分析數據

3 實驗結果

3.1 標準曲線的繪制

根據實驗的數據，對過氧化苯甲酰標準溶液繪制標準曲線，以過氧化苯甲酰標準溶液的濃度為橫坐標，以高效液相色譜測定的過氧化苯甲酰標準溶液的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線如圖9所示.

圖9 過氧化苯甲酰標準液的標準曲線

3.2 面粉樣品中過氧化苯甲酰的含量計算

樣品中過氧化苯甲酰的質量=濃度*溶液體積

面粉中BPO含量=BPO的量/面粉的量

表10 面粉中BPO含量

通過以峰面積和濃度繪制標準曲線的定量分析，以及計算結果，可以得出：用高效液相色譜法測定面粉中過氧化苯甲酰的含量為0.01353g/kg，符合國家標準0.06g/kg，是食用者可選的健康面粉.并且，高效液相色譜法可以快速測出色譜圖，該方法準確測定含量，對測試結果有較高的準確度，因此，高效液相色譜法的應用前景十分廣泛.

參考文獻：

〔1〕雷根虎,熊曉虎,霍艷敏.高效液相色譜法測定面粉中過氧化苯甲酰的含量[J].西北大學學報，2006,36（6）：911-914.

〔2〕戚麗,胡穎蕙,張正竹.高效液相色譜法測定面粉中過氧化苯甲酰的含量[J].安徽農業大學學報，2006,33(4)：560-562.

〔3〕宋悅,侯彩云.過氧化苯甲酰檢測方法的試驗研究[J].中國糧油學報,2005,20(5)：124-126.

〔4〕周冬芝,趙靜.面粉中過氧化苯甲酰檢測方法比較分析[J].農產品加工,2012（9）：136-138.

〔5〕侯彩云,石文貞,王啟輝.小麥粉中過氧化苯甲酰含量定性檢測方法的研究[J].糧油食品科技,200816（1）：53-54.

〔6〕裴翠錦,姚國光,張穩蟬.面粉中過氧化苯甲酰含量的測定[J].安徽農業科學.2010,38(24)：13384-13385.