菊花腦花活性成分提取工藝及揮發油成分分析

賈小麗，董藝凝，師海榮，余文文，李裕嬌，王 婷

（滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000）

菊花腦通常被稱作為黃菊仔、黃花葉.菊花腦的原產地是中國，菊花腦中含有豐富的的營養物質、適應性強、易栽培等等眾多的優良特點，在安徽、江蘇等地作為蔬菜廣泛種植.目前我國種植較多的板葉菊花腦，還有一小部分地區種植的小葉菊花腦[1-2].菊花腦主要有兩部分組成：一部分菊花腦的莖葉，另一部分為菊花腦花.菊花腦的莖葉含有較多的活性成分因此其可以作為蔬菜日常食用也可以作為藥材使用.也是因為菊花腦花里含有很多的揮發油，所以和菊花茶一樣可以做為日常茶品食用[3-4].菊花腦的莖葉可以炒、拌、煮湯、餡料等.科學家對菊花腦的莖葉進行了研究，發現莖葉中脂肪、纖維素、蛋白質、礦物質的含量較高，另外還含有大量的活性物質：揮發油、黃酮、酚類、菊甙.所以經常食用菊花腦花莖葉不但可以平肝明目、清熱解毒、降血壓，還可以防治上火、皮膚病、流感等疾病[5-6].菊花腦花也和其他菊花一樣，含有大量的活性物質：揮發油、黃酮、酚類物質等[7].官艷麗等人對黃山地區菊花腦花揮發油進行了提取分析，鑒定出了出了66種組分，其中含量較多的紅沒藥醇氧化物和β-檀香醇可能是其消炎、抗菌的主要成分，與此同時還發現不同地區菊花腦花中的揮發油在組成上的有著很大的差別的，可能是菊花腦花生長環境不同導致的[8].有人對南京產菊花腦花中酚類物質進行了提取研究，發現其具有很強的抗氧化性，可以在此方面進行開發和利用[9].

目前，國內外從植物體中提取活性成分的方法主要有常規水提法、蒸餾法、聯合提取、超聲波輔助提取法、亞臨界水提取、超臨界流體萃取等[10-11].李大偉[12]采用超聲波提取法對迷迭香葉中活性成分進行提取分析，實驗確定了最佳的提取劑濃度、超聲頻率、超聲時間、料液比；何小珍[13]等人使用最常使用的蒸氣蒸餾法對野菊花揮發油進行提取并且采用氣質聯用技術對揮發油的成分分離鑒定，一共鑒定出66個組分，占總量的77.32%；趙永敢[14]采用微波輔助提取法確定了提取菊花腦中多酚物質得最佳工藝.然而安徽滁州地區的菊花腦花鮮有關注，本次研究采用常規水提法和超聲波輔助提取法對滁州本地的菊花腦花中的黃酮和總酚進行提取并將兩種方法進行對比分析；然后通過氣質聯用對水蒸氣蒸餾法所得菊花腦花揮發油進行成分分析；對開發和利用本地菊花腦資源有積極意義.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原材料

材料：新鮮的菊花腦花（從滁州附近農村采摘）

前處理：將新鮮的菊花腦花洗凈、40℃烘干、粉粹、過30目篩得菊花腦花粉末，備用.

1.1.2 實驗試劑

蘆丁標準品、沒食子酸標準品；去離子水、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、福林酚、碳酸鈉、95%乙醇、無水乙醇、無水硫酸銨、正己烷，實驗中所用到的試劑均為分析純，高純氦氣.

1.1.3 實驗儀器與設備

DHG-9101-OSA型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海市三發科學儀器有限責任公司）、L3S型可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）、QP2010Ultra色譜-質譜聯用儀（日本島津公司）、UWave-1000微波紫外超聲三位一體合成萃取反應儀器（上海新儀微波化學科技有限公司）等.

1.2 實驗方法

1.2.1 常規水提法的工藝流程

準確稱取預處理后的菊花腦花粉末2g與去離子水按照不同比例混合后，置于100mL的燒杯中，將粉末和水搖勻混合后放入恒溫水槽中.處理一段時間后將其取出冷卻、過濾，最后用提取劑定容到100mL.

1.2.2 超聲波輔助提取法的工藝流程

準確稱取預處理后的菊花腦花粉末2g與不同濃度得乙醇按照不同比例混合后，置于100mL的燒杯中，將粉末與不同濃度得乙醇溶液搖勻混合后放入超聲波提取器.超聲波處理一段時間后將其取出冷卻，過濾、定容到100mL.

1.2.3 菊花腦花黃酮的測定

亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉比色法

1.2.4 菊花腦花總酚的測定

福林酚法

1.2.5 常規水提法工藝條件優化

常規水提法：首先選取水浴溫度、料液比、提取時間這三個因素來進行單因素實驗，研究各個單因素對菊花腦花提取液里黃酮和總酚得率的影響，初步確定出一個最佳提取條件.然后以提取液黃酮和總酚得率作為實驗指標，選用L9(33)正交表進行正交實驗，最終可以得到提取菊花腦花黃酮和總酚最優的提取條件.

（1）單因素實驗

①水浴溫度對菊花腦花黃酮和總酚得率的影響

準確稱取5份2.00g菊花腦花粉末，在樣品中分別加入70mL的去離子水，把5個樣品依次放入水浴溫度分別為 50℃、60℃、70℃、80℃、90℃中處理80min后，將樣品取出冷卻、過濾，最后使用提取劑將濾液定容到100mL.取原液稀釋到適當的倍數后，按照1.2.3和1.2.4測定黃酮和總酚得率.每個實驗重復三次.

②料液比對菊花腦花黃酮和總酚得率的影響

準確稱取5份2.00g菊花腦花粉末，在5個樣品中分別加入 50mL、60mL、70mL、80mL、90mL 的去離子水，于70℃下提取80min后，將樣品取出冷卻、過濾，最后使用提取劑將濾液定容到100mL.取原液稀釋到適當的倍數后，按照1.2.3和1.2.4測定黃酮和總酚得率.每個實驗重復三次.

③提取時間對菊花腦花黃酮和總酚得率的影響

準確稱取5份2.00g菊花腦花粉末，在5個樣品中分別加入70ml的去離子水，在70℃的水浴里處理 40min、60min、80min、100min、120min 后，將樣品取出冷卻、過濾，最后使用提取劑將濾液定容到100mL.取原液稀釋到適當的倍數后，按照1.2.3和

1.2.4測定黃酮和總酚得率.每個實驗重復三次.

（2）正交實驗

通過選取水浴溫度、料液比、提取時間這三個因素，然后在分別設置三個實驗水平，采用L9（33）正交表進行正交實驗，以篩選出一個最優的提取條件.

1.2.6 超聲波輔助提取法工藝條件優化

超聲波輔助提取法：選取提取劑濃度、料液比、超聲時間、超聲功率來進行單因素實驗，研究各個單因素對菊花腦花提取液里黃酮和總酚得率的影響，初步確定出一個最佳提取條件.然后以提取液中黃酮和總酚得率作為考察指標，后續實驗選用L9(34)正交表來進行，最終可以得到提取菊花腦花黃酮和總酚最優的提取條件[15-16].

（1）單因素實驗

①提取劑濃度對菊花腦花黃酮和總酚得率的影響

準確稱取5份2.00g菊花腦花粉末，在5個樣品中按序加入濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇60mL.各樣品依次在300W的超聲功率下處理30min后，將樣品取出冷卻、過濾，最后使用提取劑將濾液定容到100mL.取原液稀釋到適當的倍數后，按照1.2.3和1.2.4測定黃酮和總酚得率.每個實驗重復三次.

②料液比對菊花腦花黃酮和總酚得率的影響

準確稱取5份2.00g菊花腦花粉末，在樣品中依次加入 70%的乙醇溶液 40mL、50mL、60mL、70mL、80mL.各樣品按依次在300W的超聲功率下處理30min后，將樣品取出冷卻、過濾，最后使用提取劑將濾液定容到100mL.取原液稀釋到適當的倍數后，按照1.2.3和1.2.4測定黃酮和總酚得率.每個實驗重復三次.

③超聲時間對菊花腦花黃酮和總酚得率的影響

準確稱取5份2.00g菊花腦花粉末，在樣品中分別加入70%的乙醇溶液60mL.各樣品依次在300W 功 率 下 處 理 10min、20min、30min、40min、50min后，將樣品取出冷卻、過濾、定容到100mL.取原液稀釋到適當的倍數后，按照1.2.3和1.2.4測定黃酮和總酚得率.每個實驗重復三次.

④超聲功率對菊花腦花黃酮和總酚得率的影響

準確稱取5份2.00g菊花腦花粉末，在樣品中分別加入70%的乙醇溶液60mL.各樣品依次在100W、200W、300W、400W、500W 的實驗條件下處理30min后，將樣品取出冷卻、過濾、定容到100mL.取原液稀釋到適當的倍數后，按照1.2.3和1.2.4測定黃酮和總酚得率.每個實驗重復三次.

（2）正交實驗

以實驗中黃酮和總酚的得率作為實驗指標，通過選取提取劑濃度、料液比、超聲功率、超聲時間這四個因素，然后在分別設置三個實驗水平，使用L9（34）正交表進行正交實驗，以篩選出一個最優的提取條件.

1.2.7 菊花腦花揮發油成分分析

（1）揮發油的提取

準取稱取干燥的菊花腦花30g置于精油快速提取器內，倒入1000mL水.出油口處放置一個裝有正己烷的燒杯，通過水蒸氣蒸餾法處理3h.得到混合液后分離出正己烷，加入適量的無水硫酸鈉對溶液進行脫水處理后.使用旋轉蒸發器將溶液濃縮到10mL，取樣進行氣質聯用分析，最后采用NIST14譜庫進行鑒定.

（2）GC-MS條件

氣相色譜：色譜柱 RTX-5MS（30mm×0.25mm×0.25μm）；升溫程序：開始溫度為60℃，保持4min.以4℃/min升至130℃，保留5min.再以6℃/min升至280℃，保留5min.進樣口溫度：250℃；載氣為高純氦氣，流速為1mL/min；進樣量1μL；分流比：14：1.

質譜條件：電離方式EI，電子能70ev，四級桿溫度160℃，掃描范圍：40-500amu.

2 結果與分析

2.1 常規水提法的單因素實驗結果分析

2.1.1 水浴溫度對黃酮和總酚得率的影響

圖1 水浴溫度對黃酮和總酚得率的影響

由圖1可知，在水浴溫度上升的同時黃酮和總酚的得率也在上升，在溫度為80℃時達到最高；隨后在增加溫度時候，二者得率略有降低.溫度升高使得菊花腦花細胞壁發生破裂，細胞內的物質加速流出；當溫度過高時會促使黃酮和總酚發生氧化，從而使得二者提取率降低.因此確定溫度80℃最為適宜.

2.1.2 料液比對黃酮和總酚得率的影響

圖2 料液比對黃酮和總酚得率的影響

由圖2可知，當料液比升至1：35的時候提取液黃酮和總酚得率最高，繼續增加料液比二者得率逐漸減小.原因分析是逐漸增加料液比的時候，使細胞內外的濃度差變大，加快細胞內的物質流出，在料液比1：35流出速率最快.隨后繼續增加料液比時，就相當于對整個體系進行了稀釋，使得物質的流出速率降低，因而造成提取率下降.從實驗結果最終確定料液比1：35最佳.

2.1.3 提取時間對黃酮和總酚得率的影響

由圖3可知，當提取時間為80min的時候提取液中的黃酮和總酚的得率達到最大，再延長時間二者的得率就呈現下降趨勢.原因分析是長時間加熱會對破壞細胞內的物質，影響黃酮和酚類物質的穩定性，使之發生氧化、聚合、降解等反應.因此確定80min最適宜時間.

圖3 提取時間對黃酮和總酚得率的影響

2.2 常規水提法的正交實驗結果分析

以菊花腦花提取液中的黃酮和總酚得率作為考查指標，采用L9(33)正交表來進行實驗，因素水平安排見表1，正交實驗結果與分析見表2.

表2 常規水提法的正交實驗結果分析

通過分析表中的R值可以發現，實驗中的三個因素對菊花腦花提取液中的黃酮和總酚得率影響的主次分別為水浴溫度、提取時間、料液比.根據K值，結合黃酮和總酚得率分析得出，最優的提取條件是A2B2C3，選取1：35的料液比，在80℃的水浴下提取100min.最終黃酮的得率為12.41mg/g，總酚的得率為7.58mg/g.

2.3 超聲波輔助提取法的單因素實驗結果分析

2.3.1 提取劑濃度對黃酮和總酚得率的影響

圖4 提取劑濃度對黃酮和總酚得率的影響

由圖4可以看出，隨著提取劑濃度的不斷增加的同時，黃酮和總酚的得率也在增加，在60%達到最高.原因分析是當提取劑濃度較低時，不利于體系中的有效成分溶解和析出；當提取劑濃度過高時，會造成提取劑難以進入細胞內部，從而使二者得率又出現降低的現象.因此確定60%的乙醇溶液作為提取劑最為適宜.

2.3.2 料液比對黃酮和總酚得率的影響

圖5 料液比對黃酮和總酚得率的影響

由圖5可知：當料液比升至1：30的時候提取液中的黃酮和總酚得率最高，若繼續增加料液比二者得率又逐漸減小.分析原因是當料液比相對較低時，單位菊花腦花細胞吸收的能量較高，超聲波促使細胞破碎程度較好，從而菊花腦花細胞中的有效成分更易溶出；當料液比相對較高時，單位菊花腦花細胞吸收的能量較低，使細胞破碎不盡完全，從而影響黃酮和總酚的得率.因此確定最適料液比為1：30.

2.3.3 超聲時間對黃酮和總酚得率的影響

圖6 超聲時間對黃酮和總酚得率的影響

由圖6可知：當超聲時間增加到30min時，提取液中的黃酮和總酚的得率達到最高；再延長時間二者的得率就呈現下降趨勢.分析原因是隨著時間的增加，菊花腦花細胞被粉碎的幾率越大，使得細胞中的物質可以更快的溶出，所以黃酮和總酚得率逐漸升高；但如果超聲時間過長會產生很多熱量，從而影響菊花腦花中各成分的穩定性，從而使黃酮和總酚得率略有降低.最終確定30min為最適宜超聲時間.

2.3.4 超聲功率對黃酮和總酚得率的影響

圖7 超聲功率對黃酮和總酚得率的影響

由圖7可知：當超聲功率增加至200W的時候提取液中黃酮和總酚得率最高，繼續增大超聲功率時二者得率逐漸減小.分析原因是隨著超聲功率的增加，超聲的空化強度亦增強，分子擴散就越劇烈，所以黃酮和總酚得率逐漸上升；但當超聲功率增大到一定值后，空化趨于飽和，就會產生大量無用氣泡，從而降低空化強度，從而使黃酮和總酚得率降低.因此確定超聲功率200W最為適宜.

2.4 超聲波輔助提取法的正交實驗結果分析

以菊花腦花提取液中黃酮和總酚得率作為考查的指標，選用L9(34)正交表來進行實驗，因素水平安排見表3，正交實驗結果與分析見表4.

表3 正交實驗因素水平表

表4 超聲波輔助提取法的正交實驗結果分析

通過分析表中R值可以得知，實驗中的四個因素對菊花腦花提取液中的黃酮和總酚得率影響主次依次是提取劑濃度、料液比、超聲功率、超聲時間.根據K值可以分析得出，提取黃酮最優工藝參數為A2B3C1D2，提取總酚最優工藝參數為A2B3C3D2；菊花腦花黃酮和總酚最優組合僅在超聲時間上存在差異.再結合黃酮和總酚得率，可知最優組合是A2B3C1D2；另外，由于超聲時間對實驗影響較低，綜合生產成本和能耗上考慮，最終選取A2B3C1D2為最優工藝參數，即料液比為1：35加入60%濃度的提取劑，在200W的超聲功率下處理20min；此時提取液中的黃酮得率為20.34mg/g、總酚得率為7.97mg/g.

2.5 菊花腦花揮發油成分分析

圖8 菊花腦花揮發油成分測定色譜圖

表5 菊花腦花揮發油的化學成分

組號 保留時間/min 化合物名稱 分子式 相對分子質量 相對百分含量/%41 17.670 紅沒藥醇 C15H26O 222 0.80 42 17.745 檀香醇 C15H24O 220 5.87 43 17.815 棕櫚酸甲酯 C17H34O2 270 1.20 44 18.615 鄰苯二甲酸二異丁酯 C16H22O4 278 2.03 45 19.575 左旋乙酸冰片酯 C12H20O2 196 4.83 46 33.600 十氫二甲基甲乙烯基萘酚 C15H26O 222 0.89 47 48.440 鄰苯二甲酸二酯 C24H38O4 390 1.51 48 50.590 正三十四烷 C34O70 478 0.78 49 53.105 正三十六烷 C36H74 506 1.88 50 54.645 香樹脂醇 C30H50O 426 3.41

經過GC-MS分析，從送檢的樣品中一共檢出50種揮發性成分（見表5），其中含量較高的有樟腦（9.92%）、β-倍半水芹烯 （7.75%）、石竹烯（5.98%）、檀香醇（5.87%）.色譜圖見圖8.

3 結論

本文采用單因素和正交實驗對兩種不同的方法提取菊花腦花黃酮和總酚的工藝進行優化，以黃酮和總酚的得率為指標，獲得的優化工藝條件：①常規水提法將粉粹的菊花腦花按照1：35料液比添加去離子水，混合均勻后在80℃的水中提取100min，黃酮和總酚的得率分別為12.41mg/g和7.58mg/g.②超聲波輔助提取法將粉碎的菊花腦花按照1：35的料液比添加60%的乙醇，混合均勻后在200W的功率下超聲20min，黃酮和總酚的得率分別為20.34mg/g和7.97mg/g.超聲波輔助提取法對黃酮物質的提取率明顯高于常規水提法，而對總酚的提取率無較大影響.

使用氣質聯用技術對菊花腦花中的揮發油成分進行分析，共鑒定出大概50種物質，其中含量較高的有樟腦（9.92%）、β-倍半水芹烯（7.75%）、石竹烯（5.98%）、檀香醇（5.87%）.

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