RP-HPLC梯度洗脫法測定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中乙酸的含量

施伶俐，戴根來，鄭轉(zhuǎn)弟

（1.安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088；2.合肥久諾醫(yī)藥科技有限公司，安徽 合肥 230031）

鹽酸帕唑帕尼是一種新型的多靶點(diǎn)氨酸激酶抑制劑，對血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）、血小板源性生長因子受體（PDGFR）和干細(xì)胞因子受體（c-kit）具有抗增殖作用和抗血管生成作用.該藥品由葛蘭素史克公司研發(fā)，2006年歐洲藥品管理局（EMEA）授予孤兒藥資格，2009年10月美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市[1].臨床主要用于多種腫瘤疾病，如腎細(xì)胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等的治療，均有較為顯著的療效[2].

2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽為鹽酸帕唑帕尼合成過程中的中間產(chǎn)物，盡管國內(nèi)外對鹽酸帕唑帕尼的合成工藝做過很多改進(jìn)[3-5]，但合成該中間體產(chǎn)物的過程中仍需要加入冰醋酸，所以，乙酸是合成路線中會(huì)引入的雜質(zhì)成分，對后期的合成反應(yīng)及終產(chǎn)物鹽酸帕唑帕尼的純度會(huì)產(chǎn)生影響.控制2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中的乙酸的含量，對終產(chǎn)物的質(zhì)量具有重要意義，故本研究采用高效液相色譜法，建立2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中乙酸的含量測定方法，為控制雜質(zhì)含量提供一定的參考.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

Agilent1120高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；

Agilent1120紫外檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；Mettler Toledo AB135-S電子天平（德國梅特勒公司）；

JL-DT60型超聲波清洗器.

1.2 試劑

乙酸對照品（含量99.8%，SIGMA公司）；

乙酸、磷酸為分析純；甲醇為色譜純；水為純化水.

2 方法與結(jié)果[6]

2.1 色譜條件

TSKgel ODS-100V色譜柱（4.6×150mm，5μm）；

0.05%磷酸 - 甲醇溶液梯度洗脫：0～5min（100：0），6～15min（20：80），16～20min（100：0）；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；

流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL.

2.2 樣品的制備

2.2.1 空白溶劑

取磷酸0.5mL，精密量取，加1000mL純化水進(jìn)行稀釋，搖勻，作為空白溶劑.

2.2.2 對照品溶液

取乙酸對照品250mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液（2.503mg/mL）.取貯備液2.0mL，精密量取，置100mL容量瓶中加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（50.06μg/mL）.

2.2.3 供試品溶液

稱取2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽0.10g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加空白溶劑適量超聲溶解，待溶解完全后，放冷，繼續(xù)加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

2.2.4 混合溶液

取對照品貯備液0.2mL，精密量取，取供試品0.10g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加空白溶劑適量超聲溶解，待溶解完全后，放冷，繼續(xù)加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合溶液.

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密量取空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液、混合溶液20μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定.結(jié)果表明，混合溶液中乙酸與供試品分離度好，空白溶劑無干擾.

2.4 檢測限和定量限試驗(yàn)

取乙酸對照品溶液1.0mL，精密量取，用空白溶劑溶解并稀釋至適當(dāng)濃度的溶液，精密量取20μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，按信噪比S/N≈3和S/N≈10定義檢測限和定量限，結(jié)果乙酸檢測限為0.30μg/mL、乙酸定量限為1.00μg/mL.

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

精密量取乙酸對照品貯備液（2.503mg/mL）0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL 置于 100mL 容量瓶中，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻.6份溶液分別精密量取20μL，注入高效液相液相色譜儀進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，乙酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，回歸分析得回歸方程為

結(jié)果表明，乙酸在1.00μg/mL～100.10μg/mL濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

圖1 乙酸對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5.2 精密度試驗(yàn)

取線性關(guān)系考察項(xiàng)下對照品溶液（50.06μg/mL），精密量取20μL注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果RSD為0.71%，表明精密度良好.

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批6份2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽供試品0.10g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加空白溶劑適量超聲溶解，待溶解完全后，放冷，繼續(xù)加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.精密量取20μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定.結(jié)果乙酸平均含量為0.0127%，RSD為1.16%，表明重復(fù)性良好.

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取線性關(guān)系考察項(xiàng)下對照品溶液（50.06μg/mL），室溫放置，精密量取 20μL 分別于 0、1、2、4、8、12 小時(shí)注入高效液相色譜儀，測定峰面積，計(jì)算RSD為1.06%，表明對照品溶液穩(wěn)定性良好.

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

乙酸對照品溶液制備：精密稱取乙酸對照品499.9mg，分別置100mL的容量瓶中，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻.精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得.

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

稱取2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽0.10g，精密稱定，共稱取12份，分別置10mL容量瓶中，加適量空白溶劑超聲溶解，再分別精密加入0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL的乙酸對照品溶液，按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下方法制備成供試品溶液并同法測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1.

結(jié)果表明，乙酸在10%～150%濃度范圍內(nèi)，回收率為100.3%，RSD為0.92%，加樣回收率良好.

2.5.6 耐用性試驗(yàn)

稱取2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽0.10g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加空白溶劑適量超聲溶解，待溶解完全后，加入對照品貯備液（2.503mg/mL）0.2mL，繼續(xù)加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.在更改分析條件的情況下分別精密量取20μL注入高效液相色譜儀中，考察方法的耐用性，結(jié)果見表2.

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測定及含量限度的確定

稱取三個(gè)批次2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽各0.10g，精密稱定，置10mL容量瓶中，加空白溶劑適量超聲溶解，待溶解完全后，放冷，繼續(xù)加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

稱取乙酸對照品250.0mg，精密稱取，置100mL容量瓶中，加空白溶劑稀釋至刻度，搖勻.精密量取2.0mL，置100mL容量瓶中，加空白溶劑稀釋成每1mL含50μg的溶液作為對照品溶液.

精密量取上述溶液各20μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中乙酸的含量，試驗(yàn)結(jié)果見表3.

表3 樣品含量測定結(jié)果

結(jié)果表明，三批供試品的百分含量接近，且均小于含量限度（0.05%），由上述結(jié)果可知2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中乙酸的含量均符合規(guī)定.

3 討論

本課題采用高效液相色譜法測定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中乙酸的含量，因?yàn)橛袡C(jī)相可在較低壓力下進(jìn)行色譜分析的優(yōu)點(diǎn)，更有利于色譜柱的使用，因此選用甲醇-水系統(tǒng)更為適宜.參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中乙酸的含量測定，為了使乙酸的保留時(shí)間合適，故選用了洗脫效果更好的梯度洗脫.

通過對比供試品與對照品中乙酸的含量來確定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中的乙酸是否符合規(guī)定.同時(shí)，為了進(jìn)一步考察，進(jìn)行了方法學(xué)研究，包括線性關(guān)系考察、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)、耐用性試驗(yàn)以及含量限度的測定等等，結(jié)果均符合要求.采用RP-HPLC法測定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中的乙酸含量的方法靈敏度高，操作簡單，可準(zhǔn)確、有效測定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚鹽酸鹽中的乙酸含量.

參考文獻(xiàn)：

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〔4〕王永珍,趙硯瑾,李庶心.鹽酸帕唑帕尼的合成工藝改進(jìn)[J].精細(xì)化工中間體,2013,43(2)：46-47.

〔5〕祁浩飛,王兵,劉冰妮.帕唑帕尼鹽酸鹽的合成[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2011,28(1)：58-60.

〔6〕冀云濤,朱小玲,李斌鑫,等.RP-HPLC法同時(shí)測定蒙藥復(fù)方協(xié)日嘎-4中梔子苷、京尼平-1-O-β-D-龍膽二糖苷、西紅花苷-1、西紅花苷-3的含量[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2016,47(6)：604-608.