兩個可食鵝膏菌的形態學及rDNA～ITS測序鑒定

田慧敏，田博宇

（赤峰學院 生命科學學院，內蒙古 赤峰 024000）

鵝膏菌屬(Amanita)隸屬于擔子菌門（Basidiomycotina）、層菌綱(Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、鵝膏菌科(A-manitaceae)，是有毒大型真菌中較特殊、較有價值的世界廣布性大屬，其物種具有非常豐富的多樣性.全世界已描述且被承認的約500種，我國約80種[1].主要特征為菌蓋初期卵形，后期呈凸透鏡形或平展，菌蓋常有外菌幕碎片殘留，菌褶離生或近離生，白色，菌柄中生，易與菌蓋分離，柄基部常常膨大成球形，菌環有或無，菌托環狀，苞狀或鱗片狀，孢子印白色，孢子橢圓形，近球形，光滑，往往含一大油滴[2].鵝膏菌多與樹木形成外生菌根，促進森林的發育，該屬也有許多優質食用菌，如橙蓋鵝膏A.caesarea有雞蛋菌的美名，營養豐富，十分鮮美.然而大部分種具有毒性，含鵝膏毒肽、鬼筆毒肽、毒蠅堿，產生神經精神型中毒癥狀[3]，還有少數為劇毒菌，如白毒傘A.verna，號稱“毀滅天使”.在世界各地每年都有人誤食毒菌而死亡，而大多數死亡原因是誤食了有毒鵝膏，因此鵝膏菌的準確鑒定尤為重要.傳統鑒定方法往往受到環境的影響較大，因此菌物學家紛紛引入分子生物學手段對該屬真菌進行物種鑒別，以期結果更加準確可靠[4～9].筆者對2個赤峰地區鵝膏菌標本利用形態學和ITS片段測序相結合的方法進行分類鑒定，為鵝膏菌的準確鑒定提供依據和方法.

1 材料與方法

1.1 標本來源

供試標本CFSZ10041、CFSZ10261由田慧敏等采自赤峰地區巴林右旗和松山區，拍攝生境照片后，晾干、編號，超低溫冷凍處理后存放于赤峰學院菌物標本室（CFSZ）.

1.2 形態鑒定

鑒定方法采用宏觀特征、顯微結構與化學試劑反應相結合的方法.宏觀特征子實體大小用游標卡尺測量新鮮子實體2-5個，使用體式顯微鏡觀察菌蓋菌柄附屬物，顏色的判斷主要依據采集時拍攝的彩色照片，顯微觀察通常4-5%KOH作浮載劑，測量擔孢子30個、菌絲、擔子、囊狀細胞以20個為限.

1.3 ITS鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取

采用CTAB法：子實體干品菌蓋部分(含菌褶)用液氮研磨，提取基因組DNA[2]，并使用北京鼎國公司的DNA純化試劑盒對提取的DNA 1.3.2 rDNA-ITS區進行PCR擴增及測序.

PCR的擴增體系為：PCRcolorlessmix25μL，ITS1(TCCGTAGGTG AACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)引物（20μmol/L）各 1μL，模板 DNA2μL，ddH2O22μL，反應總體積為50μL.擴增反應在德國eppendorf公司的5331型PCR擴增儀上進行，94℃預變性3min；95℃變性 40s；58℃退火40s；72℃延伸1min，共34個循環；最后于72℃補平5min，終止溫度為4℃.PCR產物純化后委托上海生工生物科技有限公司完成.

1.3.1 ITS序列比較和系統發育分析

將已測得的ITS序列利用DNAMAN等處理后提交UNITE網站進行檢索，將所得的相似序列轉換為FASTA格式，用MEGA5.1軟件中的Alignment程序對序列進行多重對位排比，并利用Analysis程序采用最大似然法構建系統發育樹，用Kimura2-parameter模式計算遺傳距離，Bootstrap循環1000次.

2 結果與分析

2.1 形態學鑒定結果

經形態學鑒定結果CFSZ 10041為淡青灰鵝膏Amanita lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin，CFSZ 10261為杏黃鵝膏Amanita crocea(Quél.)Singer.

2.1.1 淡青灰鵝膏Amanita lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin

菌蓋直徑3.8～5.0cm，半球形或平展，灰白色至淺青灰色，中央色深，被白色，不規則形狀的菌幕殘片，易脫落，菌蓋邊緣有長條紋，干后條紋處稍變棕黃色，邊緣撕裂，（圖1～A），菌肉白色，薄，約 1～2mm，無明顯氣味，菌褶近離生，白色，有短菌褶，菌柄 8.0～11.3cm，粗 0.5～0.7cm，白色，有不明顯的絨毛，干后絨毛變黃色，基部膨大近球形，菌托袋狀或苞狀，分裂成兩瓣或多瓣，白色，具微細絨毛，有稀疏的黃褐色小疣，地下生，菌環缺如（圖1～B）.

孢子 （7.2～）10.1～14.4×（6～）8.2～10 （～12.0）μm，[Q=1.00～1.57（～1.85），Q=1.23±0.21]，寬橢圓形或橢圓形，有的近球形，含一大油滴，有小尖，非淀粉質（圖1～3）.擔子33.6～57.6（～67.2）×10.1～14.4μm，無色，有黃色內含物，棒狀，上部膨大，有四個小梗，基部無鎖狀聯合（圖1～4）.褶側囊狀體無，菌蓋表皮由菌絲組成，往往頂端膨大，頂端細胞大小為 50.0～72.0×10.0～21.6μm（圖 1～E）.菌幕由囊狀細胞和菌絲組成，囊狀細胞無色，20～42.4×14.0～18.0μm，無色薄壁菌絲，分枝，有隔膜，直徑 2.9～4.8μm（圖 1～F）.

研究標本：內蒙古赤峰市巴林右旗，賽罕烏拉自然保護區，東溝蒙古櫟林CFSZ 10041，2013年8月12日，劉鐵志、田慧敏等.

圖1 A.lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin子實體形態及微觀結構

與該種相似的其他灰色菌蓋的鵝膏有A.vaginata、A.malleata和A.fraudolenta，但是A.vaginata菌蓋深灰色，菌托袋狀純白色，有微細絨毛[10～11]，A.malleata 菌托質脆，易碎，A.fraudolenta菌柄具有褐色的線狀覆蓋物.而A.lividopallescens鑒別特點菌蓋有碎片狀菌幕殘留，菌柄基部袋狀有黃褐色小疣，且菌幕由囊狀細胞和無色菌絲組成，孢子寬橢圓形至近球形Q=1.00～1.57[12～13].分子鑒定結果顯示A.beckeri與該種親緣關系近，但是從形態學角度，A.beckeri菌蓋很黏，易剝離，灰棕色或赭褐色，菌蓋菌幕片狀，多，且由菌絲組成，故將該標本鑒定為A. lividopallescens，該種為鵝膏亞屬（Subgenera Amanita）灰鵝膏組（Section Vaginatae）主要分布于歐洲橡樹下，在我國首次發現，屬中國新記錄種，記載高溫烹調后可食用[12].

2.1.3 杏黃鵝膏Amanita crocea(Quél.)Singer

子實體中等大，菌蓋直徑4.5～6.0cm，平展，濕時稍粘，橘黃色或杏黃色，中央色深，無菌幕，邊緣有條紋，菌肉厚，白色，無特殊氣味.菌褶白色，后變淡黃色，密，不等長.菌柄長 12.5～17.5cm，粗 0.7～1.3cm，圓柱形，基部稍膨大，白色，中空.無菌環，菌托白色，苞片狀（圖 2～A,B）.

孢子 9.6～12（～14.4）μm×（7.2～）8.4～10.0（～11.4）μm，[Q=1.50～2.14，Q=1.76±0.18]，橢圓形，近球形，表面光滑，有小尖，無色，無淀粉質反應（圖2～C）.擔子36.0～57.6×8.6～10.1μm，短棒狀，中部膨大，（圖 2～D），無囊狀體，菌蓋表皮由輻射狀排列的菌絲組成，菌絲無色透明，直徑8.4～14.4μm，有的頂端膨大，膨大細胞大小為36～50.4×11.5～15μm（圖 2～E），菌柄表皮菌絲無色，常見 H 形，有的菌絲膨大成倒梨形，大小為 25～42×10.5～16μm（圖 2～F）.

研究標本：內蒙古赤峰市巴林右旗，賽罕烏拉自然保護區，榮升景區，樺林地上散生CFSZ 10261，2013年8月14日，劉鐵志、田慧敏等.

圖2 杏黃鵝膏A.crocea(Quél.)Singer子實體形態及微觀結構

該標本與A.fulva外形很像，但A.fulva菌蓋具褐色色調，且有片狀菌幕，而杏黃鵝膏A.crocea菌蓋偏于橘黃色，菌蓋無菌幕殘留，記載可食[2,11,12].

2.2 ITS序列分析

將4個標本測得的ITS序列與通過BLAST檢索比對從NCBI的GenBank數據庫獲得32個與供試鵝膏科具有較高相似度的物種（見表1）

2.3 系統發育分析

以鱗鵝膏組的A.manginiana作為外群，對CFSZ 10041、CFSZ 10261的ITS序列及相關序列等36個ITS序列構建系統發育樹，結果聚為三類，分別為鵝膏亞屬（Subg.Amanita）的鵝膏組（Sect.Amanita）、和鞘托鵝膏組（Sect.Vaginatae）和鱗鵝膏組（Sect.Lepidella），CFSZ 10041 和 A.lividopallescens聚在一起，支持率70%，CFSZ 10261與A.crocea聚在一類，支持率86%，都屬于鞘托鵝膏組（Sect.Vaginatae）.

表1 與供試鵝膏屬4個標本rDNA～ITS序列相似的物種

綜合上述，形態學鑒定方法和ITS測序法相結合，將CFSZ10041鑒定為A.lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin,CFSZ10261為杏黃鵝膏A.crocea(Quél.)Singer.

圖3 供試標本和其最相似物種的ITS序列構建的系統發育樹

3 討論

赤峰地區鵝膏科真菌資源豐富，鑒定方法主要以形態為主，本研究將傳統形態鑒定法和rDNA～ITS序列測序分析法相結合鑒定兩個常見鵝膏菌，鑒定結果相互補充印證，較為準確、科學，同時本研究發現了一個中國新記錄種，該研究不僅對于認識我國東北地區鵝膏屬的物種多樣性具有較重要的科學意義.

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