基底剛度對人宮頸癌HeLa細胞生長影響的體外研究△

趙軒宇，焦思萌，宋丹，陳嬌，商若天，張強，劉思迪，孔為民#，韓東

1首都醫科大學附屬北京婦產醫院婦瘤科，北京 100006

2國家納米科學中心，北京 100190

宮頸癌是威脅女性生命健康的主要疾病。目前宮頸癌的研究主要集中于癌細胞本身，而對其生存環境在腫瘤發生發展過程中的作用鮮有研究。從腫瘤微環境角度出發，通過改變某些環境因素抑制腫瘤細胞生長或提高現有治療方法的效果，或許可以為宮頸癌治療提供新的思路。臨床工作中大部分宮頸癌組織質地較硬，提示宮頸癌細胞及其微環境成分與正常組織不同，這種差異可以通過某些微納力學參數綜合體現，如流體靜力壓、剪切力、壓縮力和張力等[1]，剛度是一項重要的參數，參與細胞的生長、活化、分化和遷移等過程[2-4]。本研究通過模擬不同組織器官的基底剛度，觀察HeLa細胞的生長情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 宮頸癌HeLa細胞株購于美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基購于美國Hyclone公司；胎牛血清（澳洲血源）購于美國GIBCO/Invitrogen公司；CCK-8細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒購于日本Dojindo公司；4’，6二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、羅丹明標記的鬼筆環肽（rhodamine phalloidin）、Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠IgG（goat anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 488）單克隆抗體、小鼠抗人微管蛋白單克隆抗體（mouse anti-alpha tubulin monoclonal antibody）均購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 不同基底剛度培養皿 采用多聚水凝膠聚丙烯酰胺（polyacrylamide）模擬不同組織的基底剛度。0.5、5.0、25.0 kPa分別模擬淋巴結、肺臟和正常宮頸組織的基底剛度，以普通塑料/玻璃培養皿作為對照，其基底剛度約為1.0×106kPa。可控剛度多聚水凝膠培養皿購于北京德潤豐科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 采用含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和L-谷氨酰胺的DEME培養基，于37℃、5%CO2條件下培養宮頸癌HeLa細胞。

1.2.2 細胞增殖檢測 采用CCK-8細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8法）檢測細胞增殖情況。取對數生長期HeLa細胞，按照10 000/cm2的密度分別接種于0.5、5.0、25.0、1.0×106kPa（塑料基底）的24孔板中，每天細胞換半液，細胞培養3 d，每天采用CCK-8法檢測各組細胞活性（加入10%培養基總體積的CCK-8溶液，37℃、5%CO2條件下孵育3 h，酶標儀測定450 nm的吸光度值），并繪制生存曲線，計算細胞倍增時間，計算公式參照文獻[5]，Td=t×log2/（logNt－logN0），其中Td為細胞倍增時間，t為培養時間，N0為細胞接種數，Nt為培養t小時后總細胞數量。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察細胞的形態差異 宮頸癌HeLa細胞以10 000/cm2的密度接種于厚度為35 mm的不同基底剛度和塑料基底的培養皿上，37℃、5%CO2條件下培養48 h，倒置顯微鏡20倍和40倍下觀察細胞形態，每個培養基隨機留取3個視野圖片。

1.2.4 環境掃描電子顯微鏡下觀察細胞的形態差異 宮頸癌HeLa細胞以10 000/cm2的密度接種于不同基底剛度和普通細胞爬片上，37℃、5%CO2條件下培養48 h，固定，乙醇梯度脫水后，利用CO2臨界點干燥儀進行干燥；利用環境掃描電子顯微鏡的低真空模式，觀察不同基底剛度上培養的HeLa細胞成像。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞的骨架差異細胞遷移等行為與細胞骨架息息相關，為了觀察基底剛度對HeLa細胞骨架裝配的影響，用羅丹明標記的鬼筆環肽對細胞骨架蛋白F-actin進行染色，DAPI對細胞核染色，用抗微管蛋白單克隆抗體和Alexa Fluor 488標記的二抗對微管蛋白進行染色。在單光子激光共聚焦顯微鏡40倍物鏡下進行觀察。成像中細胞核經DAPI染色后呈藍色，微管蛋白（α-Tublin）經染色后呈綠色，肌動蛋白經染色后呈紅色。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均值比較采用單因素方差分析。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 倒置顯微鏡下HeLa細胞的形態

HeLa細胞在不同基底剛度上培養48 h后，其鋪展和形態基本穩定。將細胞移至倒置顯微鏡（20倍物鏡）下，細胞鋪展狀態和細胞形態顯示，0.5 kPa水凝膠培養皿上培養的宮頸癌HeLa細胞不能完全鋪展，大部分的細胞形態呈圓形，細胞貼壁不牢，輕輕晃動培養基部分，細胞可晃動；隨著基底剛度增加，細胞鋪展面積逐漸增加，細胞貼壁愈加牢固，細胞形態呈多邊形或梭形，詳見圖1。采用Image J 2.1.4.7圖像處理軟件測量不同基底剛度上培養的細胞的最長直徑/最短直徑以及細胞鋪展面積，數據經單因素方差分析后顯示，不同基底剛度組的最長直徑/最短直徑、細胞鋪展面積比較，差異均有統計學意義（F=15.54、77.21，P﹤0.01），詳見表1。

圖1 倒置顯微鏡下不同基底剛度上培養的宮頸癌HeLa細胞形態（×20）

表1 不同基底剛度上培養的宮頸癌HeLa細胞的最長直徑/最短直徑、細胞鋪展面積情況（±s）

表1 不同基底剛度上培養的宮頸癌HeLa細胞的最長直徑/最短直徑、細胞鋪展面積情況（±s）

基底剛度（kPa）0.5（n=13）5.0（n=13）25.0（n=9）最長直徑/最短直徑1.07±0.04 1.78±0.44 2.41±0.87細胞鋪展面積（μm2）38.12±9.12 46.18±7.41 68.36±22.54 1.0×106（n=9）3.44±1.53 186.11±47.85

2.2 環境掃描電子顯微鏡下HeLa細胞的形態

HeLa細胞在不同基底剛度上培養48 h，環境掃描電子顯微鏡的低真空模式下不同基底剛度上培養的HeLa細胞成像顯示，0.5 kPa水凝膠培養皿中HeLa細胞的鋪展情況最差，細胞呈圓形，細胞周圍可見少量的絲狀偽足，細胞偽足稀疏且短小；5.0 kPa水凝膠培養皿中HeLa細胞的鋪展情況稍好于0.5 kPa，細胞多呈梭形或類圓形，細胞周圍可見絲狀偽足，細胞偽足稀疏且短小；25.0 kPa水凝膠培養皿中HeLa細胞呈不規則形狀鋪展，細胞周圍可見片狀偽足和絲狀偽足，細胞偽足比較細小；1.0×106kPa普通塑料培養皿中HeLa細胞鋪展情況最好，細胞多呈片狀，細胞周圍可見帶狀偽足和絲狀偽足，細胞偽足豐富且纖長。（圖2）

圖2 環境掃描電子顯微鏡下不同基底剛度上培養的宮頸癌HeLa細胞的形態特點

2.3 單光子激光共聚焦顯微鏡下細胞的骨架裝配

單光子激光共聚焦顯微鏡對不同基底剛度上HeLa細胞骨架成像顯示，0.5 kPa水凝膠基底上培養的HeLa細胞，其肌動蛋白和微管蛋白彌散分布在細胞質中，隨著基底剛度增加，細胞骨架逐漸成型，細胞發生極化現象；5.0 kPa水凝膠基底上，HeLa細胞已發現具有方向性纖維束（應力纖維）；25.0 kPa水凝膠基底和1.0×106kPa玻璃基底上，應力纖維逐漸變粗變長，相互交聯形成網狀，其方向與細胞長軸基本平行。（圖3）

圖3 免疫熒光法檢測HeLa細胞在不同剛度基底上細胞骨架纖維的裝配差異（×40）

2.4 不同基底剛度上HeLa細胞的生長情況

采用CCK-8法，每天檢測不同基底剛度上培養的宮頸癌HeLa細胞的活性，根據光密度值繪制細胞的生長曲線后顯示，較大基底剛度上培養的HeLa細胞比小基底剛度上HeLa細胞先進入對數生長期，詳見圖4A。以48 h培養為基礎計算細胞倍增時間后顯示，0.5、5.0、25.0、1.0×106kPa基底剛度上培養的HeLa細胞，其倍增時間分別為60.40、39.43、27.79、26.34 h，細胞倍增時間隨著基底剛度的增加而縮短，詳見圖4B。

圖4 不同基底剛度上HeLa細胞的生長曲線和倍增時間

3 討論

剛度是物理學中的概念，描述材料或結構在受力時抵抗彈性變形能力的強弱，也可以描述生物組織的力學性質，是微納力學的重要參數。生物組織的剛度可以通過原子力顯微鏡或壓痕儀進行測定[6]。Leventa等[7]采用不同方法測量部分組織剛度，結果顯示不同組織的剛度不盡相同，而且相同組織的不同狀態，如纖維化和癌變等，剛度存在很大的差異。同樣，宮頸組織在不同的生理病理狀態下，其剛度不斷變化，如妊娠狀態下隨著孕周的增加，宮頸組織的剛度趨于減小[8]；隨著宮頸病變嚴重程度的增加，宮頸組織的剛度逐漸增加[9]。剛度不僅參與細胞的生長、分化和遷移等過程，還與宮頸的病理生理狀態息息相關。國內鮮有學者研究細胞生存環境剛度的變化對細胞生長的影響，所以本研究模擬常見的宮頸癌轉移器官的剛度，即0.5、5.0、25.0 kPa，分別模擬淋巴結、肺臟和正常宮頸組織的基底剛度[7]，研究不同基底剛度上HeLa細胞的形態和生長情況。

3.1 基底剛度對HeLa細胞形態的影響

細胞與其周圍環境發生力學相互作用時，常伴隨細胞的形態學變化。有研究發現，大多數細胞，如成纖維細胞和上皮細胞等，更趨于在較大剛度的基底上鋪展[10]，其原因可能是細胞在較大剛度的基底上可以產生更大的張力，更利于細胞向周圍鋪展。另有研究發現，細胞可以通過黏著斑蛋白感受細胞外界應力的變化，調節細胞骨架狀態，改變細胞鋪展狀態；但黏著斑蛋白表達水平與剛度可能無相關性[11]。這提示細胞形態和細胞骨架的影響因素繁多，由多種理化因素共同調控。

本研究結果顯示，隨著基底剛度的增加，細胞的鋪展面積和最長直徑/最短直徑明顯增加，差異有統計學意義（P﹤0.01）；細胞絲狀偽足數量和長度也逐漸增加，1.0×106kPa基底剛度上甚至出現片狀偽足。本研究進一步分析了不同剛度的基底對HeLa細胞骨架的影響，其肌動蛋白和微管蛋白的熒光成像顯示，較大的基底剛度上，應力纖維分布廣泛且貫穿細胞質，隨著剛度的減少，應力纖維數量亦減少。這說明HeLa細胞對剛度的變化比較敏感。

3.2 基底剛度對HeLa細胞增殖的影響

對于貼壁生長的細胞，貼壁是細胞增殖的必要條件。基底剛度可以影響HeLa細胞的鋪展程度和細胞骨架的狀態，或多或少可以改變細胞的增殖情況。Tilghman等[12]發現，細胞增殖速度與基底剛度呈正相關，但并非所有細胞均對基底剛度敏感。大量的研究探索了生物力學因素對不同細胞增殖行為的影響，亦得出類似結果[13-15]。此外，Wang等[13]不僅通過改變基底剛度促進了表皮細胞的增殖，還誘導了表皮細胞的分化。有研究發現，基底剛度可以改變一些腫瘤細胞對某些化療藥物的反應，如Hui等[16]發現不同基底剛度上培養的Hep-2細胞經順鉑和5-氟尿嘧啶治療后，軟基底上Hep-2細胞凋亡減少。Feng等[17]發現，在較大基底剛度的培養基中培養的乳腺癌MCF-7細胞，對紫杉醇的藥物殺傷作用反應更敏感。本研究中宮頸癌HeLa細胞屬于“剛度依賴性”細胞，較大的基底剛度上HeLa細胞的倍增時間縮短，增殖率增加。

綜上所述，宮頸癌HeLa細胞的形態和增殖情況隨著基底剛度的變化而變化。這提示，在塑料/玻璃培養皿中進行細胞水平體外研究不能反應細胞生長的真實情況，需要考慮剛度等微納力學因素對細胞生長的影響，準確地模擬細胞體內生長環境。宮頸癌HeLa細胞在不同基底剛度上的不同生長狀態亦提示，不同組織器官上癌細胞的生長速度存在差異，但與宮頸癌轉移部位的關系仍需進一步研究。此外，與剛度相關的基因也可能成為宮頸癌治療的新靶點。

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