ID3基因在逆轉骨肉瘤順鉑耐藥中的作用及其機制的研究

池曉峰，姜宏，楊東

吉林省腫瘤醫院骨及軟組織腫瘤外科，長春 130000

骨肉瘤是一種高度侵襲性的惡性腫瘤，源自原始的骨形成間充質細胞，主要發生在骨骼生長和修復迅速的區域周圍，如膝關節、股骨下骨和上脛骨[1]。順鉑（cisplatin，DDP）是骨肉瘤患者的常用化療藥物之一，具有廣譜的抗腫瘤活性，但臨床上初始化療緩解后產生的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現象嚴重影響其治療效果[2-3]。分化抑制因子（inhibitors of differentiation，ID）在生物體中廣泛表達，并且在多種腫瘤中呈現高表達的趨勢[4]。ID3是ID蛋白家族的重要成員之一，其表達具有細胞類型的特異性[5-7]。據相關文獻報道，ID3的表達差異與前列腺癌[5]、肺腺癌[6]以及卵巢癌[7]等多種腫瘤相關，然而，其在骨肉瘤中的作用機制及骨肉瘤細胞的順鉑耐藥性方面尚不明確。本研究首先篩選了骨肉瘤順鉑耐藥株；其次運用熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和 Western blot方法，檢測了ID3基因與順鉑耐藥的關系；最后通過細胞毒性實驗與凋亡檢測，輔以ID3基因過表達的手段，探討了ID3基因過表達對骨肉瘤細胞順鉑耐藥性的逆轉作用，以期為骨肉瘤順鉑耐藥性的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人骨肉瘤細胞株U-2 OS購自美國ATCC公司；DDP購自Sigma公司；CCK8試劑購自碧云天生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；人ID3基因過表達載體及其陰性對照載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司；ID3、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、Caspase-3、RhoE和人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自Abcam公司。

1.2 順鉑耐藥細胞株的篩選

以DDP為誘導劑，對人骨肉瘤細胞株U-2 OS采用大劑量沖擊與逐步增加劑量相結合的方法，誘導建立順鉑耐藥細胞系U-2 OS/DDP。U-2 OS/DDP和U-2 OS細胞置于RPMI 1640培養基，37℃、5%CO2孵育箱中培養。

1.3 細胞毒性實驗

取對數生長期內U-2 OS/DDP細胞和U-2 OS細胞，以每孔3×104/ml接種于96孔板中，培養24 h后，用不同濃度DDP（0、0.5、1、5、10、15、20、30、40 μg/ml）進行細胞分組處理，實驗過程中每組數據設置3個復孔作為平行實驗，并采用CCK8方法檢測U-2 OS/DDP細胞和U-2 OS細胞的生長抑制作用，并計算其半數抑制濃度（IC50）和耐藥指數（resistant index，RI）。

1.4 實時熒光定量PCR檢測ID3基因的表達

采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測U-2 OS/DDP細胞和U-2 OS細胞中ID3的mRNA表達水平。采用TRIzol方法提取細胞的總RNA。總RNA用DNase除去殘留的基因組DNA后，使用具有隨機引物的逆轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）進行逆轉錄。使用以下引物將得到的cDNA用作ABI 7500儀器上的PCR擴增的模板，人ID3正向引物：5'-ATGAAGGCGCTGAGCCCGGTGC-3'，反向引物：5'-ACGGCCGAGTCAGTGGCAAAAGC-3'；GAPDH正向引物：5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3'，反向引物：5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。實驗過程中每組數據設置3個復孔作為平行實驗，GAPDH作為內參對照。

1.5 Western blot檢測ID3蛋白表達

采用Western blot法檢測U-2 OS/DDP細胞和U-2 OS細胞中ID3蛋白的表達水平。常規方法提取細胞總蛋白后，使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）凝膠來分離等量的蛋白質，并轉移到硝化纖維過濾膜（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上，5%脫脂奶粉封閉后，使用一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（ID3、P-gp、Caspase-3和RhoE）孵育，隨后進行增強化學發光（enhanced chemiluminescent，ECL）顯影。采用Image J分析軟件進行灰度值定量分析，并將ID3與GAPDH的灰度比值作為ID3蛋白的相對表達量，實驗過程中每組數據設置3個復孔作為平行實驗。

1.6 ID3基因過表達對骨肉瘤細胞順鉑耐藥性的逆轉作用

人ID3基因過表達載體及其陰性對照載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司，并通過脂質體Lipofectamine 2000將ID3基因過表達載體及其陰性對照載體導入U-2 OS細胞和U-2 OS/DDP細胞。不同濃度DDP（0、0.5、1、5、10、15、20、30、40 μg/ml）處理U-2 OS/DDP細胞后，采用CCK8方法再次檢測各組細胞的生長抑制率；同時，選取0、1、2 μg/ml的轉染組細胞，37℃、5%CO2培養箱培養24 h后，用Annexin V-FITC和PI雙重染色法結合流式細胞術，評估經歷凋亡的細胞百分比。實驗過程中每組數據設置3個復孔作為平行實驗。Annexin V陽性和PI陰性染色的細胞是早期凋亡細胞，而具有Annexin V和PI陽性染色的細胞處于細胞凋亡的晚期階段。

1.7 統計學分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用方差分析，采用Pearson相關分析法進行數據相關性分析。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑處理對骨肉瘤細胞生長功能的影響

不同濃度的順鉑藥物作用于親本細胞株U-2 OS和順鉑耐藥株U-2 OS/DDP細胞24 h后，隨著順鉑濃度（0.5、1、5、10、15、20、30、40 μg/ml）的增加，細胞株 U-2 OS（r2=0.885，P=0.004）及 U-2 OS/DDP（r2=0.970，P﹤0.001）的生長抑制率亦隨之升高，并呈現出一定的劑量依賴性，詳見表1。DDP對U-2 OS細胞的 IC50為 6.58 μg/ml，對U-2 OS/DDP細胞的 IC50為 19.89 μg/ml，U-2 OS/DDP 細胞對 DDP 的耐藥指數（RI）為3.02。

2.2 骨肉瘤細胞中ID3基因的mRNA表達

qRT-PCR檢測U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞中ID3基因的mRNA表達水平差異。結果顯示，U-2 OS細胞中ID3基因的mRNA表達水平為（0.85±0.04），明顯高于U-2 OS/DDP細胞的（0.31±0.04），差異有統計學意義（t=16.534，P﹤0.001）。（圖1）

表1 不同濃度的DDP對U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞生長抑制率的影響（%，±s）

表1 不同濃度的DDP對U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞生長抑制率的影響（%，±s）

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圖1 qRT-PCR法檢測U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞中ID3基因的mRNA表達

2.3 骨肉瘤細胞中ID3蛋白的表達

Western blot法檢測ID3蛋白在U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞中的表達差異。結果顯示，U-2 OS細胞中ID3蛋白的表達水平為（0.30±0.03），明顯高于U-2 OS/DDP細胞的（0.14±0.03），差異有統計學意義（t=6.532，P﹤0.001）。（圖2）

圖2 U-2 OS細胞及U-2 OS/DDP細胞中ID3蛋白表達情況

2.4 ID3基因過表達對骨肉瘤細胞耐藥性的逆轉作用

U-2 OS/DDP細胞轉染ID3過表達載體和陰性對照載體后，分別加入不同濃度DDP（0.5、1、5、10、15、20、30、40 μg/ml），ID3過表達耐藥株U-2 OS/DDP細胞（ID3+組）與陰性對照耐藥株U-2 OS/DDP細胞（對照組）的生長抑制率情況詳見表2。與對照組比較，加入DDP后ID3+組U-2 OS/DDP細胞的抑制率明顯上升，DDP耐藥性明顯下降（r2=0.936，P﹤0.001），細胞的IC50下降至 9.83 μg/ml，其逆轉倍數為2.02倍。

2.5 ID3基因表達對U-2 OS/DDP凋亡的影響

U-2 OS/DDP細胞轉染ID3過表達載體和陰性對照載體后，分別加入不同濃度DDP（0、1、2 μg/ml），流式細胞儀Annexin V-FITC和PI雙染法測定細胞凋亡率，詳見圖3。與對照組比較，ID3+組U-2 OS/DDP細胞凋亡率提高（P﹤0.05）；隨著DDP濃度的增高，對照組和ID3+組的早期凋亡細胞所占百分比均隨之增加。

表2 ID3基因過表達對U-2 OS/DDP細胞耐藥性的逆轉作用（%，±s）

表2 ID3基因過表達對U-2 OS/DDP細胞耐藥性的逆轉作用（%，±s）

生長抑制率DDP（μg/ml）0.5 151 0 15 20 30 40 ID3+組21.86±0.23 26.54±1.63 42.64±2.65 51.29±2.75 60.72±4.28 71.35±0.21 76.81±3.23 80.92±3.54對照組5.68±1.02 8.82±0.95 18.28±1.67 29.36±3.66 36.35±2.84 46.52±1.56 51.63±4.87 57.55±0.42

圖3 不同濃度DDP作用下ID3基因表達對U-2 OS/DDP細胞凋亡的影響

2.6 Western blot法檢測ID3基因過表達對P-gp、RhoE和Caspase-3表達的影響

為了進一步探討ID3基因對U-2 OS/DDP順鉑耐藥性的影響，本研究采用了Western blot法檢測U-2 OS/DDP細胞中P-gp、RhoE和Caspase-3的表達情況，檢測結果詳見圖4。對照組RhoE、Caspase-3、P-gp蛋白表達分別為（0.148±0.005）、（0.196±0.012）、（0.662±0.013），與對照組比較，ID3+組上調了RhoE（0.325±0.003，t=57.31，P﹤0.05）和Caspase-3蛋白的表達水平（0.797±0.024，t=38.37，P﹤0.05），但卻下調了P-gp蛋白的表達水平（0.159±0.004，t=63.50，P﹤0.05）。

圖4 ID3過表達對U-2 OS/DDP細胞中P-gp、RhoE和Caspase-3表達的影響

3 討論

ID3是一種螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉錄因子，負責調控堿性螺旋-環-螺旋（bHLH），進而抑制細胞分化、促進細胞增殖[8]。有研究發現，ID3在生物體中起著致癌的作用，并且在不同的惡性腫瘤中有表達差異[5-7]。ID3對腫瘤的正向調節作用，使其有望成為腫瘤治療的新靶點。順鉑具有抗癌活性，是癌癥治療的重要化療藥物，但由于腫瘤細胞產生的耐藥性，使得順鉑藥物的治療達到了瓶頸。有研究發現，腺病毒介導的ID3基因的過表達效應可以抑制肺癌細胞A549的細胞增殖，促進其凋亡[6,9]。Koyama等[10]用CDDP誘導骨肉瘤細胞MG63時發現，CDDP誘導的細胞凋亡與ID3基因的短暫上調有關。本研究中，篩選了U-2 OS細胞的順鉑耐藥株（U-2 OS/DDP），并對親本株U-2 OS和耐藥株U-2 OS/DDP中的ID3mRNA水平和蛋白水平進行了檢測，結果發現，耐藥株U-2 OS/DDP中ID3的轉錄水平和蛋白水平均明顯低于親本株的U-2 OS。

腫瘤耐藥株中，凋亡抑制基因的表達增加，同時伴隨著細胞增殖能力的增強以及凋亡能力的減弱。Koyama等[10]的研究發現，ID3基因過表達的骨肉瘤細胞MG63中，CDDP的誘導可增強ROS效應和Caspase-3的活性。Trougakos等[11]研究發現，ID3基因高表達的骨肉瘤細胞中，與細胞增殖相關的PCNA反而低表達。Chen等[9]研究發現，ID3基因的表達強度與A549細胞的順鉑耐藥性有關，ID3基因的過表達可以逆轉耐藥株的順鉑耐藥性。本研究為探究ID3基因在骨肉瘤順鉑耐藥株U-2 OS/DDP中的耐藥作用，先后對U-2 OS和U-2 OS/DDP、陰性對照耐藥株（對照）和ID3基因過表達耐藥株（ID3+）受不同濃度的順鉑作用后的細胞增殖活性進行了檢測，結果顯示，DDP對U-2 OS細胞的IC50為6.58 μg/ml，對U-2 OS/DDP細胞的IC50為19.89 μg/ml，U-2 OS/DDP細胞對DDP的耐藥指數（RI）為3.02。與對照組比較，加入順鉑后ID3+組U-2 OS/DDP細胞的抑制率明顯上升，順鉑耐藥性明顯下降，這表明ID3基因過表達對骨肉瘤細胞耐藥性的逆轉作用。值得注意的是，DDP在5 μg/ml時即可明顯抑制親本U-2 OS細胞的增殖，對順鉑耐藥株U-2 OS/DDP也有一定程度的抑制作用，但在DDP的濃度達到20 μg/ml左右時，U-2 OS/DDP細胞的增殖抑制率才能達到相應的效果。同時，順鉑耐藥細胞株U-2 OS/DDP的RI達到3.0以上，說明U-2 OS/DDP耐藥株持有較好的耐藥特性，達到后續實驗的要求。ID3基因過表達后，DDP對U-2 OS/DDP細胞的IC50降至 9.83 μg/ml，其逆轉倍數為 2.02 倍。隨后，本研究又對對照組耐藥株和ID3+組耐藥株中的細胞凋亡情況進行了檢測，結果發現，ID3+組細胞的凋亡率高于對照組，且隨著DDP濃度的增加，早期凋亡細胞所占百分比亦隨之增加。結合U-2 OS和U-2 OS/DDP細胞中ID3基因和蛋白的表達水平差異，推測ID3基因的表達降低骨肉瘤細胞的順鉑耐藥性，其過表達效應可以逆轉U-2 OS/DDP細胞對順鉑的耐藥性。此結果進一步證明，ID3基因在骨肉瘤細胞順鉑耐藥機制中起到關鍵作用。

MDR現象的產生是導致化療失敗的主要原因之一。P-gp由MDR1基因編碼，可與藥物結合，隨后將藥物排出體外，從而降低胞內藥物濃度，即產生耐藥性[12]。P-gp的表達高低與腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度呈負相關[13]。RhoE是RhoGTPase家族成員之一，在肺癌細胞中表達下調，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[14]，而RhoE的上調表達，則可能起到抑制腫瘤的作用[15]。腫瘤細胞的耐藥性與細胞凋亡呈負相關，Caspase-3作為細胞凋亡的執行者，與腫瘤細胞的耐藥性密切相關[16]。本研究采用Western blot法對ID3+耐藥株和對照耐藥株中的P-gp、RhoE和Caspase-3的蛋白水平表達進行了檢測。結果顯示，ID3過表達后，P-gp蛋白水平下降，RhoE和Caspase-3的蛋白水平上升，此結果進一步體現出ID3基因在骨肉瘤細胞順鉑耐藥中的逆轉作用。

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