泮托拉唑對胃癌細胞MKN-45增殖與凋亡的影響

王鳳記，盧艷君，程相欽

山東省寄生蟲病防治研究所（山東省消化系統疾病防治中心）普外科，山東 濟寧 272033

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率和病死率分別位居全國惡性腫瘤的第2位和第3位，且均呈逐年上升趨勢[1-2]。質子泵抑制劑（ptoton pump inhibitors，PPI）作為一種抑酸藥物，通過Vaculor H+-ATPase或H+/K+-ATPase，通過胃壁細胞，進入小管腔聚集發揮作用，常常用于酸性疾病的治療，如胃潰瘍、消化道出血、胃癌等[3-6]。泮托拉唑作為第三代PPI，不僅對酸具有穩定性，還有著良好的靶位專一性，比第二代PPI的生物利用度提高了7倍，而且不影響其他藥物在肝臟中的代謝，因此被廣泛地應用于多種酸性疾病的治療當中，如能夠降低胃潰瘍發病率，對消化道出血療效顯著[7-8]。另外，相關研究還顯示泮托拉唑能顯著誘導SMCC-7721肝癌細胞凋亡，抑制HCT116結腸癌細胞及SGC-7901胃癌細胞增殖[9-11]。但泮托拉唑對于胃癌細胞的增殖抑制及凋亡誘導作用機制報道較少，因此本研究將對此展開探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株

胃癌細胞MKN-45購于中國科學院細胞庫。

1.2 試劑與儀器

泮托拉唑購自杭州中美華東制藥有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E、GAPDH單克隆抗體均購自美國宜百康公司；四甲基偶氮唑鹽（methye thiazolye telrazlium，MTT）、DMEM培養基均購自美國Gibco公司；Hoechst染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自南通碧云天生物技術有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司；DMI4000B倒置熒光顯微鏡購自德國萊卡公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀、DYCZ-25D型轉印電泳儀均購自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自美國伯樂公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；MK3酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測MKN-45細胞活力 將5×103個MKN-45細胞接種到6孔板，培養24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑處理MKN-45細胞48 h，加入20 μl的MTT孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩使結晶物溶解，在酶標儀波長560 nm處測光密度（optical density，OD）值。每組平行3個復孔。

1.3.2 Hoechst染色檢測MKN-45細胞形態 將8×103個MKN-45細胞接種到6孔板，培養24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑處理MKN-45細胞48 h，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定，Hoechst染色液染色5 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，凋亡的細胞熒光更強，細胞核發白，呈現皺染。每組平行3個復孔。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期 將8×103個MKN-45細胞接種到6孔板，培養24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑處理MKN-45細胞48 h，收集1×105/ml個細胞，加入5μl的核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）并吹打均勻，37 ℃孵育1 h，再加入PI染液，室溫避光孵育30 min，于1 h內采用流式細胞儀進行細胞周期檢測分析。

1.3.4 Western blot檢測細胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及Cyclin E蛋白的表達 將8×103個MKN-45細胞接種到6孔板，培養24 h后，采用0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑處理MKN-45細胞48 h，收集細胞，加入細胞裂解液，裂解30 min，離心獲得的上清液即是總蛋白。接著利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉膜30～50 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液（兔抗人Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E、GAPDH單克隆抗體，稀釋度為1∶100）孵育，4℃過夜；二抗溶液室溫孵育1～2h。于凝膠成像系統中曝光。

1.4 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（±s）進行描述，多組間比較采用F檢驗，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 泮托拉唑對MKN-45細胞活力的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45細胞48 h后，四組MKN-45細胞活力分別為（0.78±0.08）、（0.64±0.07）、（0.50±0.05）、（0.37±0.04），四組比較，差異有統計學意義（F=24.383，P=0.000）；且與 0 μg/ml比較，10、20、40 μg/ml泮托拉唑作用后MKN-45細胞活力明顯降低，差異有統計學意義（P﹤0.01）。（圖1）

圖1 泮托拉唑對MKN-45細胞活力的影響

2.2 泮托拉唑對MKN-45細胞凋亡的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用MKN-45細胞48 h后，經Hoechst染色實驗發現，10、20、40 μg/ml泮托拉唑能使細胞核發白，呈現皺染。（圖2）

圖2 泮托拉唑對MKN-45細胞凋亡的影響（Hoechst染色，×200）

2.3 泮托拉唑對MKN-45細胞周期的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用MKN-45細胞48 h后，經流式細胞術檢測發現，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑能逐漸使細胞周期阻滯在G1期，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用后，G1期 MKN-45 細胞比例較0 μg/ml增高，差異有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 泮托拉唑對MKN-45細胞周期的影響（%，±s）

表1 泮托拉唑對MKN-45細胞周期的影響（%，±s）

注：*與0 μg/ml泮托拉唑比較，P<0.01

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2.4 泮托拉唑對MKN-45細胞中Bax及Bcl-2表達的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45細胞48 h后，與 0 μg/ml比較，20、40 μg/ml的泮托拉唑作用后MKN-45細胞的Bcl-2表達水平明顯下調，Bax表達水平明顯上調，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（圖3、表2）

圖3 Western blot檢測泮托拉唑對MKN-45細胞中Bax及Bcl-2表達的影響

表2 泮托拉唑對MKN-45細胞中Bax及Bcl-2表達的影響（±s）

表2 泮托拉唑對MKN-45細胞中Bax及Bcl-2表達的影響（±s）

注：與0 μg/ml泮托拉唑比較，*P<0.01

泮托拉唑濃度（μg/ml）0（n=3）10（n=3）20（n=3）40（n=3）F值P值Bax/GAPDH 0.18±0.02 0.19±0.02 0.38±0.04*1.13±0.11*10.28 0.002 Bcl-2/GAPDH 0.94±0.09 0.93±0.09*0.42±0.04*0.28±0.03*25.55 0.000

2.5 泮托拉唑對MKN-45細胞中Cyclin D1及Cyclin E表達的影響

0、10、20、40 μg/ml的泮托拉唑作用 MKN-45細胞48 h后，與0 μg/ml比較，10、20、40 μg/ml泮托拉唑能明顯下調Cyclin D1及Cyclin E表達，差異有統計學意義（P﹤0.01）。（圖4、表3）

圖4 Western blot檢測泮托拉唑對MKN-45細胞中Cyclin D1及Cyclin E表達的影響

表3 泮托拉唑對MKN-45細胞中Cyclin D 1及Cyclin E表達的影響（±s）

表3 泮托拉唑對MKN-45細胞中Cyclin D 1及Cyclin E表達的影響（±s）

注：與0 μg/ml泮托拉唑比較，*P<0.01

泮托拉唑濃度（μg/ml）0（n=3）10（n=3）20（n=3）40（n=3）F值P值Cyclin D1/GAPDH 0.92±0.09 0.29±0.02*0.16±0.01*0.05±0.00*38.45 0.000 Cyclin E/GAPDH 0.97±0.09 0.31±0.03*0.22±0.02*0.05±0.00*42.13 0.000

3 討論

pH值對于細胞各種生理功能的發揮至關重要，參與H+跨膜運輸的質子泵包括H+/K+，H+/Na+，V-ATPase等，而在真核細胞膜上起著重要作用的是V-ATPase。V-ATPase在腫瘤細胞中過度表達，抑制酵解所產生的乳酸在細胞內的聚集，繼而使腫瘤細胞避免了凋亡的命運[3-6]。而作為V-ATPase抑制劑，PPI能夠在pH﹤4的酸性環境中發揮抑酸作用，被廣泛地應用于酸性疾病的治療，且療效及安全性均得到肯定[3-6]。已有研究證實，作為第三代PPI泮托拉唑已被廣泛應用于酸性疾病的治療當中，包括胃癌[7-8]。因此，本研究以泮托拉唑為研究對象，探討泮托拉唑對胃癌細胞MKN-45增殖與凋亡的影響。

癌細胞的過度增殖、凋亡受限制是胃癌發生的重要原因[12-14]，因此，本研究首先參考相關文獻并利用MTT法檢測不同濃度的泮托拉唑對MKN-45胃癌細胞活力的影響，結果表明10、20、40 μg/ml泮托拉唑能明顯降低MKN-45細胞活力（P﹤0.01），與以往學者研究報道一致[11]。接著利用Hoechst染色檢測泮托拉唑對胃癌細胞凋亡的影響，結果表明泮托拉唑能顯著誘導細胞凋亡。細胞周期G1、S、G2期是細胞周期的主要調控點，也是眾多抗腫瘤藥物作用的主要靶點，特別是G1期。G1期是決定細胞是否能夠進入S期，是否能夠正常進行DNA復制及是否能夠進行有絲分裂的前提[15-16]。所以本研究繼續利用流式雙染技術檢測泮托拉唑對MKN-45胃癌細胞周期的影響，結果表明泮托拉唑能使細胞周期阻滯于G1期，從而說明泮托拉唑能通過阻滯細胞周期抑制MKN-45細胞增殖，并誘導細胞凋亡。

胃癌的發生機制與眾多腫瘤類似，涉及細胞凋亡基因的異常和細胞周期的紊亂等[12-13]。細胞凋亡受細胞凋亡相關基因的調控，Bcl-2家族是研究最為廣泛的細胞凋亡調控家族。其中抑凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號的傳遞，促進細胞的存活與生長[17]。而Bax還能夠自身形成二聚體，將凋亡信號傳遞到Caspase家族，使信號放大，最后誘導細胞凋亡[18]。Cyclin D1、Cyclin E是與G1期密切相關的細胞周期蛋白，Cyclin D1在生長因子等刺激下，與細胞周期依賴性蛋白4/6（CDK4/6）形成復合物，促進Rb磷酸化，并使轉錄因子E2F進入細胞核，調控細胞靶基因轉錄，推動DNA復制所需蛋白質的合成[19]。而在Cyclin D1被降解后，Cyclin E與CDK2形成復合物，代替Cyclin D1發揮作用，促使G1期向S期轉變，推動細胞周期向DNA復制發展[20]。因此，本研究繼續利用Western blot檢測泮托拉唑對MKN-45細胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及Cyclin E表達的影響，結果表明泮托拉唑能明顯下調Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E的表達，上調Bax的表達（P﹤0.01），從而阻滯細胞周期于G1期，并誘導細胞凋亡。

綜上所述，10、20、40 μg/ml的泮托拉唑能明顯降低MKN-45胃癌細胞活力，誘導細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G1期，此過程可能是通過下調Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E的表達，上調Bax的表達實現的。

[1]鄧慧鳴,劉秘,許榮華.MicroRNA在胃癌中相關靶基因的研究進展[J].癌癥進展,2016,14(10):952-954.

[2]鄒文斌,李兆申.中國胃癌發病率及死亡率研究進展[J].中國實用內科雜志,2014,34(4):408-415.

[3]劉吉龍,文國容,金海,等.質子泵抑制劑抗胃癌的研究進展[J].醫學綜述,2017,23(4):670-674.

[4]翁涵,金海,庹必光.質子泵抑制劑抗腫瘤機制的研究進展[J].醫學綜述,2017,23(3):465-469.

[5]Ko Y,Tang J,Sanagapalli S,et al.Safety of proton pump inhibitors and risk of gastric cancers:review of literature and pathophysiological mechanisms[J].Expert Opin Drug Saf,2016,15(1):53-63.

[6]李浩,施芳紅,劉菲,等.質子泵抑制劑與酸相關性疾病[J].世界華人消化雜志,2014,22(15):2073-2080.

[7]賀金凱,賀翠婷,劉鷹,等.質子泵抑制劑泮托拉唑的研究進展[J].中國藥房,2016,27(26):3732-3735.

[8]van Rensburg CJ,Cheer S.Pantoprazole for the treatment of peptic ulcer bleeding and prevention of rebleeding[J].Clin Med Insights Gastroenterol,2012,5:51-60.

[9]蔡孝莉,冉麗丹,文國容,等.泮托拉唑對肝癌細胞SMCC-7721遷移、侵襲及凋亡的影響[J].中國醫藥導報,2015,12(13):7-10.

[10]Zeng X,Liu L,Zheng M,et al.Pantoprazole,an FDA-approved proton-pump inhibitor,suppresses colorectal cancer growth by targeting T-cell-originated protein kinase[J].Oncotarget,2016,7(16):22460-22473.

[11]Shen Y,Chen M,Huang S,et al.Pantoprazole inhibits human gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells by downregulating the expression of pyruvate kinase M2[J].Oncol Lett,2016,11(1):717-722.

[12]廖毅,鄧媛,傅建偉.胃癌分子機制的研究進展[J].中國腫瘤,2014,23(1):58-62.

[13]李加樁,王凱冰,鄭紅艷,等.胃癌分子靶向藥物治療的研究進展[J].中國腫瘤,2017,26(4):279-285.

[14]喬煒,琚堅,羅金波,等.胃癌相關基因及其在治療中應用的研究進展[J].胃腸病學,2012,17(1):53-55.

[15]Sommariva S,Tarricone R,Lazzeri M,et al.Prognostic value of the cell cycle progression score in patients with prostate cancer:A Systematic Review and Meta-analysis[J].Eur Urol,2016,69(1):107-115.

[16]Cadoni G,Boccia S,Petrelli L,et al.A review of genetic epidemiology of head and neck cancer related to polymorphisms in metabolic genes,cell cycle control and alcohol metabolism[J].Acta Otorhinolaryngol Ital,2012,32(1):1-11.

[17]Hatok J,Racay P.Bcl-2 family proteins:master regulators of cell survival[J].Biomol Concepts,2016,7(4):259-270.

[18]Pietrantonio F,Biondani P,Ciurlia E,et al.Role of BAX for outcome prediction in gastrointestinal malignancies[J].Med Oncol,2013,30(3):610.

[19]劉厚廣,劉卓,姜穎,等.細胞周期蛋白與黑色素瘤的研究進展[J].中國地方病防治雜志,2015,30(1):30-33.

[20]游路寬,佘亞軍,陳初鵬.細胞周期蛋白E1與惡性腫瘤關系的研究進展[J].癌變·畸變·突變,2016,28(6):487-490.