纖維支氣管鏡檢標本微小RNA-21在非小細胞肺癌診斷中的臨床應用價值

王艷春，于呈偉，齊穎會，劉振來

朝陽市第二醫院1呼吸內科，2心胸外科，遼寧 朝陽 122000

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，近幾年肺癌的發病率持續上升，病死率居高不下，嚴重威脅著人類健康[1-2]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%左右，且發病率和病死率持續上升[3]。肺癌在早期并無明顯癥狀，大多數患者僅會出現一些常見的呼吸道癥狀，如咳嗽、胸悶等，大部分患者在就診時已處于晚期，錯過了最佳治療時機，導致患者的5年生存率大大降低[4]。盡早發現、及時診斷、盡快治療是降低肺癌病死率的根本方法。研究發現，微小RNA（miRNA）在腫瘤的發生和發展過程中起著至關重要的作用[5]。已有研究證實，微小RNA-21（miRNA-21）與甲狀腺乳頭狀癌、肝癌等多種惡性腫瘤存在一定的相關性[6]。本研究通過檢測miRNA-21在NSCLC患者中的表達水平，并探討其與細胞因子和腫瘤標志物水平的相關性，旨在為NSCLC的預防和治療提供理論依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月至2017年9月于朝陽市第二醫院接受治療的80例NSCLC患者作為NSCLC組。納入標準：①年齡≥18歲；②通過影像學和病理學檢查確診為NSCLC；③無其他系統嚴重疾病。排除標準：①臨床資料不全者；②合并其他部位原發腫瘤或肺部炎性疾病者。選取同期因咳痰、咯血等不適接受鏡檢篩查的80例肺炎或肺結核患者作為對照組。NSCLC組中，男52例，女28例；年齡52～78歲，平均（62.35±5.02）歲；鱗癌25例，腺癌25例，大細胞癌30例。對照組中，男50例，女30例；年齡50～79歲，平均（62.39±4.43）歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 纖維支氣管鏡檢 患者術前禁食7 h，術前30 min靜脈滴注阿托品0.02～0.03 mg/kg以減少呼吸道分泌物，靜脈注射咪達唑侖0.3～0.4 mg/kg進行鎮靜，并給予供氧。患者取仰臥位，根據患者具體情況給予適當全身鎮靜。使用異丙酚靜脈注射進行復合麻醉，將支氣管鏡從患者鼻腔插入，采用CT對腫瘤進行探查，并取出部分組織放入含RNAlater試劑的凍存管中，于-80℃環境下保存備用。

1.2.2 miRNA-21表達水平的檢測 采用RNA提取試劑盒（購自美國Promega公司）提取總RNA，使用分光光度儀對RNA的濃度和純度進行檢測。采用TaqMan miRNA reverse transcription kit合成全長互補脫氧核糖核酸。利用PCR儀進行熒光定量PCR檢測，以RNU6B作為內參反應體系，反應條件：15 ℃ 30 min，40 ℃ 30 min，85 ℃ 4 min，4℃儲存。應用2-△△CT法計算miRNA-21表達水平。

1.3 評價指標

觀察兩組患者的鏡檢物miRNA-21表達水平，比較兩組患者的細胞因子水平，包括γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）；比較兩組患者的腫瘤標志物水平，包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經元特異烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）和角蛋白 CYFRA21-1。分析miRNA-21水平與細胞因子、腫瘤標志物水平的相關性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 11.5軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析法。以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鏡檢物miRNA-21表達水平的比較

NSCLC組患者的鏡檢物miRNA-21表達水平為（8.29±1.15），明顯高于對照組的（1.35±0.41），差異有統計學意義（t=50.842，P﹤0.001）。

2.2 細胞因子水平的比較

NSCLC 組患者的 IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6 和TNF-α水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.001）。（表1）

表1 兩組患者細胞因子水平的比較（ng/L，±s）

表1 兩組患者細胞因子水平的比較（ng/L，±s）

2.3 腫瘤標志物水平的比較

NSCLC組患者的CEA、NSE和CYFRA21-1水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.001）。（表2）

2.4 NSCLC患者鏡檢物miRNA-21表達水平與細胞因子和腫瘤標志物水平的相關性

NSCLC患者鏡檢物miRNA-21表達水平與細胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和腫瘤標志物CEA、NSE、CYFRA21-1水平均呈正相關（P﹤0.05）。（表3）

3 討論

近年來肺癌的發病率和病死率呈逐年上升趨勢，目前已成為全球病死率最高的惡性腫瘤[7-8]。NSCLC是肺癌的一種，占肺癌的80%～85%，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌，與小細胞癌相比，其癌細胞生長分裂較為緩慢，擴散轉移相對較晚[9]。目前認為，吸煙是引發肺癌最重要的高危因素，同時輻射、肺部感染、遺傳等因素也是引發肺癌的原因[10]。肺癌患者在患病早期無特殊癥狀，常表現為胸部脹痛、痰血、低熱和咳嗽等，晚期癥狀則表現為呼吸困難、體重驟減、咳嗽嚴重、咯血等。盡管近年來手術、放療、化療等技術不斷發展，但多數肺癌患者在就診時已處于晚期，腫瘤多發生了轉移，導致患者失去了最佳治療時機，5年生存率大大降低[11]。

表2 兩組患者腫瘤標志物水平的比較（μg/ml，±s）

表2 兩組患者腫瘤標志物水平的比較（μg/ml，±s）

組別CEA NSE CYFRA21-1

表3 NSCLC患者鏡檢物miRNA-21表達水平與細胞因子和腫瘤標志物水平的相關性

目前臨床上對miRNA已有較多的研究，人類已經發現了500多種miRNA[12-13]。miRNA是一類高度保守的內源性非編碼單鏈RNA，長度為18～25個核苷酸，由高等真核生物基因組編碼，通過對基因的表達進行調節從而參與一系列生命過程[14-15]。miRNA的主要功能之一是作為基因表達的負調控因子，對細胞的增殖、凋亡、分化和代謝起到了至關重要的作用，但其作用部位和確切的生物學功能尚未確定[16-17]。研究顯示，miRNA-21位于染色體的脆性區17q23.2，其可能作為一種潛在的癌基因或抑癌基因對腫瘤的發生和發展過程產生影響[18]。miRNA-21可能與癌細胞的發生、發展和轉移有關，如在甲狀腺乳頭狀癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、膽管癌中表達水平明顯上升，發揮著癌基因的作用[19]。另有研究通過miRNA芯片與生物信息學技術人工合成miRNA-21序列，并轉染至肺癌A549細胞中，檢測細胞中PTEN基因的mRNA和蛋白表達水平，結果發現miRNA-21可能主要在翻譯水平上調控PTEN基因的表達[20]。

本研究探討了miRNA-21在NSCLC患者中的表達水平，結果顯示，NSCLC組患者的鏡檢物miRNA-21表達水平為（8.29±1.15），明顯高于對照組的（1.35±0.41），差異有統計學意義（t=50.842，P﹤0.001），表明miRNA-21在NSCLC組織中的表達水平較高，其可能通過調控凋亡相關基因的表達，從而參與腫瘤的發生和發展，進一步證實了miRNA-21的癌基因作用。炎性細胞因子在人體內通常保持平衡狀態，但一旦引起炎癥，平衡就會被破壞，導致肺部發生病理生理性改變。本研究對兩組患者的細胞因子水平進行比較，結果發現，NSCLC組患者的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.001），表明腫瘤細胞可通過分泌炎性細胞因子介導炎性反應，從而促進腫瘤的發生、侵襲和免疫抑制。通過對兩組患者的腫瘤標志物水平進行比較，結果發現，NSCLC組患者的CEA、NSE和CYFRA21-1表達水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.001）。本研究還發現，NSCLC患者鏡檢物miRNA-21表達水平與細胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α和腫瘤標志物CEA、NSE、CYFRA21-1水平均呈正相關（P﹤0.05），證實了miRNA-21可以作為肺癌的特異性腫瘤標志物，對肺癌的診斷和預后具有一定的應用價值。

綜上所述，miRNA-21在NSCLC組織中的表達水平明顯升高，且與細胞因子和腫瘤標志物水平密切相關，其對肺癌的發生和發展過程起到了重要作用，可應用于NSCLC患者的早期診斷及預后判斷，值得進行深入研究。

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