乳頭狀甲狀腺癌患者外周血TSHR mRNA表達水平及其與臨床特征的關系分析

左秀玲，王志宏，陳海燕

鄭州市第一人民醫院內分泌科，鄭州 450004

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，其中乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）是其最主要的病理類型，占甲狀腺癌的80%[1]。PTC早期患者（Ⅰ～Ⅱ期）的5年生存率可達100%，Ⅲ期患者約為93%，而Ⅳ期患者僅為51%[2-4]；因此，PTC患者的早期診斷對增加其生存率十分重要。甲狀腺癌相關腫瘤分子標志物是早期診斷的重要指標。有研究證實，多種腫瘤標志物與甲狀腺癌的發生發展密切相關[5-6]，其中促甲狀腺激素受體（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）是甲狀腺組織的特異性標志物，在甲狀腺功能和甲狀腺細胞生長過程中具有重要的調節作用；然而，已有的研究多集中于TSHR蛋白在甲狀腺癌組織中的作用，而其在PTC外周血中基因表達變化的研究相對較少，且多采用術后組織病理標本進行腫瘤標志物檢測，達不到早期鑒別診斷的目的。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，體外檢測PTC患者的外周血TSHR mRNA表達水平，探討其在PTC鑒別診斷中的應用價值，并分析TSHR mRNA表達水平與臨床特征的關系，為PTC的研究提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月至2016年6月鄭州市第一人民醫院確診的50例PTC患者作為觀察組，同期40例于鄭州市第一人民醫院體檢的健康體檢者作為對照組。觀察組患者的納入標準：①所有患者均于術后經病理學檢查確診；②臨床資料完整；③初次手術；④術前未經放化療和生物治療。排除標準：①合并心、肝、腎功能不全；②伴其他惡性腫瘤。觀察組50例患者中，男18例，女32例；年齡為26～75歲，平均為（43.4±8.2）歲；TNM分期：Ⅰ期有9例，Ⅱ期有12例，Ⅲ期有16例，Ⅳ期有13例；淋巴結轉移：有淋巴結轉移者16例，無淋巴結轉移者34例。對照組40例受試者中，男16例，女24例；年齡為25～76歲，平均為（44.1±8.1）歲。兩組受試者的年齡和性別等一般資料比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經鄭州市第一人民醫院倫理委員會批準同意，所有受試者均簽署本研究的知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集與總RNA提取 采集觀察組患者術前和對照組受試者清晨空腹外周靜脈血5 ml，立即應用Trizol試劑（購于美國Sigma Aldrich公司）從受試者全血中提取總RNA。將提取的總RNA加入 20 μl水中溶解，測光密度（optical density，OD）值。當OD260/OD280≥1.8時，可用于后續研究。

1.2.2 實時熒光定量PCR技術 根據反轉錄試劑盒（購于日本Takara公司）的說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。應用SYBR Green（購于日本Takara公司）染色，進行實時PCR分析。利用ABI7500系統（購于美國Applied Biosystems公司），按照制造商提供的方案在含1 μg cDNA的25 μl反應系統中進行實時熒光定量PCR反應，所有反應均重復3次。以β-actin作為內參，目的基因TSHRmRNA和內參β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平，引物序列如下：TSHR，Forward 5'-GCTTTTCAGGGACTATGCAATGAA-3'，Reverse 5'-AAGGGCAGTGACACTGGTTTGAGA-3'；β -actin，Forward 5'-CCAGCACAATGAAGATCAAGATCAT-3'，Reverse 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGACAGCGA-3'。實時熒光定量PCR反應的條件：95℃下10 s，95℃下5 s，57.5℃下20 s，共40個循環。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件分析數據，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TSHR mRNA的表達水平

觀察組50例患者的外周血TSHR mRNA的平均表達水平為（1.82±0.28），明顯高于對照組40例受試者的（1.01±0.03），差異有統計學意義（t=18.192，P﹤0.01）。

2.2 實時熒光定量PCR檢測結果

TSHR和β-actin基因的熔解曲線均顯示單峰，無引物二聚體形成，提示反應體系良好，無污染物干擾；擴增曲線顯示引物質量良好，PCR產物未出現非特異性產物。（圖1）

圖1 實時熒光定量PCR檢測結果

2.3 TSHR mRNA表達與臨床特征的關系

PTC患者的外周血TSHR mRNA表達水平在性別、年齡、腫瘤直徑方面比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）；PTCⅢ～Ⅳ期患者的TSHR mRNA表達水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統計學意義（F=14.381，P﹤0.01）；有淋巴結轉移患者的TSHR mRNA表達水平明顯高于無淋巴結轉移的患者，差異有統計學意義（t=4.453，P﹤0.01）。（表1）

3 討論

實時熒光定量PCR技術具有準確性高和重復性好的優點，廣泛應用于基因表達研究，僅需少量的外周血即可進行研究，可消除其他基因的干擾。本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測PTC患者外周血樣本中TSHR mRNA的表達水平，分析其與臨床特征的關系，探討TSHR mRNA在PTC診斷中的應用價值。當熔解曲線顯示為單峰時，證明實時熒光定量PCR所用引物特異性高，無二聚體，且無其他非特異性擴增。本研究中TSHR mRNA的熔解曲線為單峰，且為避免基因組DNA對研究結果的干擾，本研究所有目的基因和內參基因引物擴增產物的長度均為90～150 bp，擴增效率相近，證明本研究的數據準確可靠。

表1 PTC患者外周血TSHR mRNA表達水平與臨床特征的關系

促甲狀腺激素與其受體TSHR是調控甲狀腺功能的關鍵蛋白。正常情況下TSH與TSHR結合后可以激活腺苷酸環化酶和磷酸酯酶C，進而通過環磷酸腺苷、乙酰甘油和1，4，5-三磷酸肌醇傳遞信號，從而刺激甲狀腺細胞生長，并參與調節甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）、甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）和鈉碘轉動體（sodium iodide symporter，NIS）等表達，其中 TSHR在甲狀腺的調控中起主導作用。已有研究證實，在正常的甲狀腺細胞和癌細胞中均有TSHR表達，其表達水平存在差異[7]。王朝暉等[8]的研究顯示，應用免疫組化法檢測PTC組織和正常甲狀腺組織標本中TSHR蛋白表達情況，PTC組織中TSHR蛋白表達高于正常甲狀腺組織，這可能是甲狀腺癌發生的早期標志。這些研究表明，TSHR可以作為診斷PTC的生物標志物。

過往研究多集中于甲狀腺癌根治術后腫瘤組織中TSHR蛋白表達的變化，而外周血中其基因表達變化的研究較少。Ishikawa等[9]在甲狀腺癌患者的外周血中發現了甲狀腺細胞，且TSHR mRNA表達異常。Torosian等[10]的研究發現，正常人外周血中存在少量的甲狀腺細胞。血液中TSHR mRNA的表達與循環中的癌細胞TSHR mRNA高表達有關[11]。這些研究表明，可以通過外周血甲狀腺細胞中目的基因的變化情況診斷甲狀腺疾病。本研究對外周血單核細胞中TSHR mRNA進行相對定量檢測發現，PTC患者和健康受試者的外周血中均發現TSHR mRNA表達，且PTC患者的TSHR mRNA表達水平明顯高于健康受試者，提示外周血細胞中TSHR mRNA表達水平升高與甲狀腺病變有關。

劉翔和高明[12]采用免疫組化法檢測侵襲性PTC患者腫瘤組織中TSHR蛋白表達情況，低分化、高侵襲性、有淋巴結轉移的患者中TSHR蛋白表達水平明顯降低，且其表達水平與腫瘤惡性程度呈明顯負相關。許少偉等[13]的研究發現，PTC原發病灶中TSHR表達水平與患者的年齡、性別、TNM分期、淋巴結轉移等均無關。本研究中發現，外周血TSHR mRNA的表達水平與PTC患者的年齡、性別、腫瘤直徑無關，與之前研究一致；然而，本研究中有淋巴結轉移者的外周血TSHR mRNA表達水平明顯高于無淋巴結轉移者（P﹤0.01），推測發生淋巴結轉移的患者，其PTC癌細胞的侵襲性相對較強，更易于從組織中脫落而進入外周血，使外周血中甲狀腺細胞數量增加，從而使TSHR mRNA表達水平升高。另外，本研究發現，Ⅰ～Ⅱ期PTC患者外周血TSHR mRNA表達水平明顯低于Ⅲ～Ⅳ期患者（P﹤0.01），提示TSHR mRNA表達水平升高與PTC進展有關。

綜上所述，外周血中TSHR mRNA表達水平升高與甲狀腺病變有關，且與患者TNM分期和淋巴結轉移情況有關。本研究中所選取的樣本數量較少，且未同時研究其他TSHR相關生物標志物在PTC中的表達變化情況，在后續研究中需要進一步補充。

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