HPLC法同時測定山豆根中4種生物堿及其含量

何超然，李 哲，李 任，王麗麗，沈 素，余俊先（首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院藥學部，北京 100050）

山豆根為豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根及根莖, 具有清熱解毒、消腫利咽的功效，內含多種苦參堿類生物堿成分[1-2]。苦參堿類生物堿是以苦參堿為代表、化學結構相似的一類生物堿，主要包括苦參堿（matrine，MT）、氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）、槐果堿（sophocarpine，SC）及N-甲基野靛堿（N-methylcytisine）等[3]。隨著人們對苦參堿抗腫瘤作用分子機制研究的不斷深入，苦參堿在抗腫瘤方面的獨特作用和廣泛應用前景已引起人們的重視。苦參堿可通過誘導腫瘤細胞凋亡，干擾細胞周期等不同作用機制，針對多類型多部位的癌癥發(fā)揮作用[4-5]。本研究采用高效液相色譜法對廣西等省份的山豆根提取物中苦參堿類生物堿成分進行測定，分析出不同產地、批次樣品中成分的含量，為中藥種植的規(guī)范化質量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器和試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），包括G1314A可變波長紫外檢測器，G1322A脫氣裝置，G1310A Iso泵，G1313A自動進樣器，Agilent chemStation色譜工作站；3-18K低溫離心機（德國Sigma公司）；MS3 basic旋渦混合器（德國IKA公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵（河南鞏義市英峪予華儀器廠）；PHS-3E型pH計（上海雷磁儀器廠）；BS 124S電子天平（北京賽多利斯儀器公司）。苦參堿（批號：17061508，純度HPLC≥98%）、氧化苦參堿 （批號：17061501，純度HPLC≥98%）、槐果堿（批號：161013，純度HPLC≥98%）、N-甲基野靛堿（批號：161115，純度HPLC≥98%），以上標準品購自成都普菲德生物技術有限公司。甲醇為色譜純（Merck醫(yī)藥生物科技公司），磷酸（國藥集團化學試劑有限公司）、三乙胺（天津市福晨化學試劑廠）、磷酸二氫鉀（北京市紅星化工廠）均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取適量苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿及N-甲基野靛堿對照品，加甲醇分別配成含濃度為1 mg·L-1氧化苦參堿、1 mg·L-1N-甲基野靛堿、1 mg·L-1苦參堿、1 mg·L-1槐果堿的對照品儲備液。精密吸取苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿及N-甲基野靛堿對照品儲備液，加流動相配成濃度為0.1 mg·L-1氧化苦參堿、0.1 mg·L-1N-甲基野靛堿、0.1 mg·L-1苦參堿、0.1 mg·L-1槐果堿的混合對照品溶液。2.1.2 供試品溶液的制備[6]將來自不同省份的山豆根樣品進行編號，分別為廣西（G1、G2、G3、G4），四川（S1、S2、S3、S4）和江西（J1、J2、J3、J4）。進行洗藥、潤藥、切藥、干燥、粉碎等步驟，稱量適量，煎煮、濃縮、醇沉，靜置后取上清液，在沉淀中再加入45%乙醇，靜置后再次取上清液，并與之前得到的上清液合并，回收乙醇，消毒后加入適量原輔料，靜置吹干，得到樣品粉末。分別取樣品粉末5 mg溶于3 mL甲醇中，震蕩3次，每次3 min，間隔10 min，使其充分溶解，使用低溫離心機18 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用氮氣吹干，加300 mL甲醇進行復溶，得到待測樣品溶液。

2.2 色譜條件和方法學驗證

2.2.2 線性范圍 精密吸取各對照品儲備溶液配成濃度為1、2、5、10、100、200、500、1000 μg·mL-1的對照品溶液，進樣量20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、N-甲基野靛堿等堿類成分峰面積積分值為縱坐標（Y），進樣濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數(shù)（r）；各對照品的回歸方程見表1，結果表明，各待測物在各自濃度范圍內具有良好的線性關系。

2.2.3 精密度實驗 精密吸取同一濃度的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積積分值并計算RSD。苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿及N-甲基野靛堿的RSD分別為0.92%、1.07%、1.16%、1.12%，表明儀器具有較好的精密度。

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 The HPLC chromatograms

表1 4種生物堿成分的線性關系及線性范圍Tab 1 Linear relationship and liner rangers of four constituents

2.2.4 重復性實驗 取同一批次的山豆根樣品粉末，按“2.1”項下方法配置成6份供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積積分值，計算成分含量及相對標準偏差。結果顯示，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿及N-甲基野靛堿的RSD分別為2.21%、2.04%、2.44%、2.17%，說明多次重復測定得到的結果偏差較小，具有較高的重復性。

2.2.5 加樣回收率考察[16]精密稱取已知含量的同一樣品溶液6份，加入適量的苦參堿、氧化苦參堿、N-甲基野靛堿和槐果堿標準品震蕩混勻，離心，按照“2.2.1”項下色譜條件進行含量測定，計算4種成分的回收率、平均回收率及RSD。4種待測成分的平均回收率在98.0% ～ 102.0%，RSD均小于4.0%，表明方法具有良好的準確度。詳見表2。

表2 山豆根中4種成分加樣回收率測定結果. n = 6Tab 2 The result of recovery test of four constituents in subprostrate sophora. n = 6

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一批次的山豆根樣品粉末，按“2.1”項下方法配制成供試品溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h依次進樣，測定峰面積積分值，計算相對標準偏差。結果顯示，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿及N-甲基野靛堿的RSD分別為2.41%、1.96%、2.01%、1.99%，表明配制的供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3 樣品含量測定

取各山豆根樣品粉末，按“2.1”項下方法配置成供試品溶液，每個樣品平行2份，按“2.2.1”項下色譜條件下依次進樣測定，測得樣品中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿及N-甲基野靛堿含量，進行加和得出提取物中生物堿成分總量，結果見表3。

由以上分析可見,暴雨發(fā)生前大氣層呈現(xiàn)熱力和動力的不穩(wěn)定的結構特征,垂直風切變較明顯。暴雨期間水汽主要集中在900～500 hPa各層。

表3 不同批次山豆根4種生物堿成分含量. n = 12Tab 3 The contents of four alkaloid constituents of subprostrate sophora in different batches. n = 12

3 討論

3.1 色譜柱的選擇[3, 8, 16-17]

本實驗考察了Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Agilent NH2柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）的分離效能，氨基柱測定出的樣品峰形不好，柱長為150 mm時樣品保留時間較短，四種苦參堿類成分分離效果不佳，結果表明使用Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）能夠將各待測成分完全分開，基線平穩(wěn)，專屬性及成分峰形良好，因此確定該柱為實驗用分離柱。

3.2 流動相的選擇

參考相關文獻[8,11,18-19]，分別使用乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、甲醇-水和甲醇-磷酸鹽緩沖液等多種流動相系統(tǒng)進行檢測并比較分離效能，結果表明，以甲醇-磷酸鹽緩沖液為流動相，色譜圖中各成分保留時間有一定間隔且色譜峰的峰形較好；通過優(yōu)化流動相條件發(fā)現(xiàn)，流動相為甲醇-磷酸鹽緩沖液（20 :80）時，4種待測成分能達到較好的分離效果且保留時間相對較短，有利于對樣品中生物堿成分的定量檢測，且加入1%三乙胺溶液可以有效的減少拖尾，各成分的對稱因子適宜。同時配制不同pH（分別為5.3，5.8，6.0，6.3和6.8）的流動相并分別進行檢測發(fā)現(xiàn)，pH =6.3時四種成分分離情況及峰形較好。故選擇甲醇-磷酸鹽緩沖液（20 : 80，加入1%三乙胺，緩沖液調pH為6.3）為流動相洗脫條件。

3.3 供試品溶液制備

本實驗采用煎煮浸出法對樣品進行處理，根據(jù)藥物的性質加入適當?shù)妮o料，使中藥提取物成顆粒狀，對于稱重溶解等步驟有所幫助。

3.4 分析方法的確定

通過對照品溶液的線性方程計算，各樣品的線性范圍滿足樣品檢測，回歸方程r值滿足要求，線性關系良好。精密度考察結果顯示，連續(xù)多次對混合對照品溶液進行定量檢測，各成分峰面積的RSD均滿足要求，說明儀器具有較好的精密度。重復性考察結果顯示，連續(xù)多次對同一供試品溶液進行定量檢測，得出各成分峰面積并分別計算得到RSD滿足要求，重復性良好。穩(wěn)定性考察中將一份配制的供試品溶液分別放置0 ～ 24 h，并在不同時間節(jié)點進行定量檢測，分別計算峰面積的RSD，結果顯示供試品溶液不會隨放置時間而發(fā)生成分濃度變化，24 h內穩(wěn)定性較好。加樣回收率考察中同一供試品溶液加入適量對照品后，計算各成分的平均回收率及RSD，結果滿足要求，說明方法具有較好的準確度。

3.5 樣品含量分析

通過含量測定可以評估出不同產地的山豆根生物堿成分含量，有助于對山豆根進行生物堿成分質量評價和資源評估。本實驗對來自廣西、四川、江西三個省份的山豆根藥材中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿和N-甲基野靛堿4種生物堿成分的含量進行測定，12個樣品中苦參類生物堿成分含量高低不均。分析各生物堿成分含量可知，各生物堿成分總和相對較低，不同批次的山豆根藥材中生物堿成分的質量分數(shù)之和具有較大差異，廣西省樣品中的苦參堿類生物堿成分含量較高，四川省樣品含量較低。分別對生物堿成分含量進行分析可知，樣品中氧化苦參堿含量相對較高，槐果堿及N-甲基野靛堿含量較低，各成分含量具有較大差異。以上結果表明，4種成分在不同批次的山豆根藥材中的含量差異顯著，因此需要對山豆根中的多種成分進行同步測定才能更加全面地反映樣品的內在質量。在相關制劑制備時，也應統(tǒng)一藥材的來源、產地等相關因素，控制制劑質量及其質量標準，以保證臨床療效。

綜上，本實驗成功建立了山豆根中4個生物堿樣品的HPLC定性和定量分析方法，測定了不同產地山豆根中各生物堿的含量，該方法簡便、快捷、準確、重復性良好，表明中藥山豆根的主要生物堿成分因產地不同而存在明顯的差異，為中藥種植的規(guī)范化質量控制提供重要參考依據(jù)。

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