肺結核患者利福噴丁血藥濃度監測研究

彭明麗，陳 明，溫筱煦，趙冠人（解放軍第309醫院藥劑科，北京 100091）

結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染病，嚴重威脅人類的健康。WHO報告顯示2015年全球新發結核病例高達1040萬，而中國是新發結核最多的六個國家之一，結核病在全部死亡原因中仍排位前十[1]。結核病的治療主要依賴于針對結核分枝桿菌的長期聯合化療[2]，如何更好的利用現有的抗結核藥物成為臨床關注的焦點。

利福噴丁是一種新合成的長效利福霉素類抗生素，半衰期為11 h，其抗菌作用是利福平的4 ～ 5倍，對結核分枝桿菌，尤其對生長期結核分枝桿菌作用強，臨床上廣泛用于替代利福平抗結核治療[3]。利福噴丁的抗結核分枝桿菌作用強，其治療窗為8 ～ 30 μg·mL-1[4]，有文獻表明利福噴丁的血藥濃度個體差異較大，藥物過量時臨床不良反應肝毒性較明顯[5]。因此，對利福噴丁開展治療藥物監測（therapeutic drug monitoring，TDM）具有一定的臨床意義。其目的是保證利福噴丁抗結核分枝桿菌療效的同時盡量降低其不良反應發生率，從而使利福噴丁的臨床應用更為安全有效。為了進一步探討對結核病患者應用利福噴丁進行TDM的臨床意義，本研究選取我院服用利福噴丁的結核患者，對其血藥濃度進行測定，并對數據進行匯總分析。

1 材料

1.1 臨床資料

選取2016年7月– 2017年3月期間在我院門診或病房治療的結核患者共計67例，進行利福噴丁峰濃度（Cmax）的測定。其中男性31例，女性36例，均為漢族，年齡14 ～ 67歲，平均年齡（32.1±9.4）歲，平均體質量（57.3±17.1）kg。

1.2 儀器與試藥

API3200型三重四級桿串聯質譜儀，配有離子噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.4.1數據處理軟件（美國Applied Biosystem公司）；Prominence LC-20A超快速高效液相色譜系統，包括CBM-20A系統控制器，LC-20AD二元輸液泵，DGU-20A3脫氣裝置，SIL-20AHT自動進樣器（日本Shimadzu公司）；VDRTEX-5型旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；5420型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；MG-2200型氮氣吹干儀（東京理化器械株式會社）。利福噴丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：130541-200401）；對乙酰氨基酚對照品（內標，中國藥品生物制品檢定所，批號：100018-200408）；甲醇、乙腈為色譜純（Dikma公司）；水為Millipore制備超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm。患者血漿樣品由解放軍第309醫院結核病研究所提供。

2 方法與結果

2.1 給藥方案

67例結核患者治療方案如下：異煙肼300 mg·d-1，qd（67例）；利福噴丁450 mg·d-1，biw（67例）；吡嗪酰胺1500 mg·d-1，tid（62例）；乙胺丁醇750 mg·d-1，qd（24例人）；1000 mg·d-1，qd（38例）。納入連續服藥7 d以上的患者，并進行血藥濃度監測。

2.2 血樣采集

采血時間為服用利福噴丁4 h后，取靜脈血2 mL，置EDTA-Na真空抗凝管中，當日測定血漿中利福噴丁濃度。

2.3 血藥濃度測定方法

2.3.1 色譜條件 分析柱：Agilent Poroshell 120SB C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）；保護柱：ZORBAX SB C18柱（2.1 mm×12.5 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%醋酸溶液；進樣量：5 μL；流速：0.5 mL·min-1；梯度洗脫：0.01 ～ 3.00 min，25%甲醇；3.01 ～7.00 min，80%甲醇；7.01 ～ 10.00 min，25%甲醇。

2.3.2 質譜條件 離子源：離子噴霧離子化源（Ion spray）；離子噴射電壓（IS）：5000 V；離子源溫度（TEM）：350 ℃；源內氣體1（GS1，N2）：25；源內氣體2（GS2，N2）：45；氣簾氣體壓力（Cur Gas）：30。正離子方式檢測；掃描方式為多重反應監測（MRM）；DP：67；EP：67；CE：36；CXP：7；用于定量分析的離子反應分別為m/z 877.5→845.5（利福噴丁）和m/z 152.0→110.0（對乙酰氨基酚）。

2.3.3 溶液的配制 精密稱取利福噴丁對照品適量，加50%甲醇溶解，定量配制成300 μg·mL-1的對照品儲備液。精密稱取內標對乙酰氨基酚適量，加甲醇溶解，定量配制成161.60 μg·mL-1的內標儲備液，利福噴丁與內標儲備液置于– 20 ℃冰箱保存，臨用時用50%甲醇稀釋至30 μg·mL-1作為工作液。

2.3.4 血漿樣品的處理 取血漿樣品100 μL于1.5 mL離心管中，加入內標溶液10 μL，加入甲醇300 μL，渦旋混合1 min，離心12 min（13 200 r·min-1，4 ℃），取上清液200 μL，加入去離子純化水400 μL，渦旋混合1 min，取上清液5 μL進樣分析。

2.4 方法專屬性

分別取空白血漿，加入利福噴丁對照品溶液和對乙酰氨基酚內標溶液的樣品血漿（利福噴丁終濃度15.00 μg·mL-1，對乙酰氨基酚終濃度16.16 μg·mL-1）以及加入對乙酰氨基酚內標溶液的服用利福噴丁的患者血漿，按“2.3.4”項下方法處理，依“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，結果顯示，利福噴丁及內標對乙酰氨基酚有對稱的色譜峰和良好的分離度，其測定不受血漿中雜質峰及其他合用藥品的干擾，具有較高的專屬性。詳見圖1。

2.5 標準曲線與線性范圍

平行取人空白血漿6份各90 μL，分別加入利福噴丁工作液適量，精密配制0.60、1.50、3.00、6.00、15.00、24.00、30.00 μg·mL-1的血漿樣品，按“2.3.4”項下方法處理，“2.3.1”項下色譜條件進樣分析。以樣品與內標峰面積比值（Y）對濃度（C）進行回歸計算，結果表明利福噴丁在0.60 ～ 30.00 μg·mL-1內線性關系良好，回歸方程為：Y = 0.118 C + 0.029 5，r = 0.996 2。在上述條件下測得血漿中利福噴丁最低檢測濃度為0.60 μg·mL-1。

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.6 基質效應考察

取空白血漿90 μL于1.5 mL離心管內，按“2.3.4”項下方法處理，向獲得的上清液中分別加入適量對照品溶液，配制低、中、高3個濃度水平的樣品，每個濃度3個樣品。另于流動相溶液分別加入適量對照品溶液，同樣配制低、中、高3個濃度各3個樣品。按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，測定各色譜峰面積，求出對應濃度前者與后者峰面積的比值即為基質效應，結果表明，利福噴丁在人血漿中的基質效應為（97.01±2.89）%，定量過程不受基質效應影響。

2.7 準確度和精密度實驗

平行取3份各90 μL的空白血漿，分別加入利福噴丁工作液適量，精密配制成低、中、高3種濃度（1.50、6.00、24.00 μg·mL-1）的血漿樣品，每個濃度6份樣品，按“2.3.4”項下方法處理，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，依法測定日內與日間（3 d內）精密度，結果見表1。

表1 準確度與精密度. n = 6Tab 1 Precision and accuracy. n = 6

2.8 提取回收率與穩定性實驗

平行取3份各90 μL的空白血漿和經過“2.3.4”項下方法處理的血漿空白基質，分別加入利福噴丁工作液適量，精密配制成低、中、高3種濃度（1.50、6.00、24.00 μg·mL-1），其中每個濃度3個樣品。按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，測定各色譜峰面積，對應濃度前者與后者峰面積的比值即為其提取回收率。結果表明利福噴丁平均回收率均＞ 90%，RSD均＜ 5%，見表2。

表2 利福噴丁的提取回收率Tab 2 The extraction recovery of rifapentine

取已知利福噴丁濃度血漿樣品，分別置室溫條件下存放0、1、2、4、8、16、24 h后，按“2.3.4”項下方法處理，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，測定利福噴丁濃度，考察樣品放置穩定性。結果表明血漿樣品在室溫放置4 h穩定，RSD均＜ 15%，同時又考察了樣品在－20 ℃冰箱中存放1個星期的穩定性，結果表明樣品穩定，RSD均＜ 15%，符合規定。

2.9 利福噴丁血漿峰濃度測定結果

對67例服用利福噴丁的肺結核患者按照“2.2”項下要求采血，按“2.3.4”項下方法處理，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，另取利福噴丁低、中、高濃度（1.50、6.00、24.00 μg·mL-1）的血漿樣品各3份，作為質控隨行測定，RSD均＜ 5%，根據內標法加校正因子法計算利福噴丁濃度。

肺結核患者利福噴丁血漿峰濃度（Cmax）測定結果為1.59 ～ 39.79 μg·mL-1，測定值分布情況見表3。峰濃度與利福噴丁抗結核分枝桿菌療效密切相關，由表3可見，按治療窗為8 ～ 30 μg·mL-1[4]計，其有效率為59.70%。

3 討論

肺結核是一種由結核分枝桿菌引起的感染性疾病，其治療主要是以異煙肼和利福平為基石的一線抗結核藥聯合化療為主。其中，利福噴丁作為利福霉素類藥物的代表，相較于利福平表現出更強的抗結核療效和更好的安全性[6-7]，且一周只需服用兩次，病人依從性更好，臨床上常用于替代利福平治療肺結核。但在長期的對主要抗結核藥物血藥濃度的臨床監測中發現，服用利福噴丁的個體間血藥濃度差異過大，這已成為肺結核患者合理使用利福噴丁的一個難點。因此對其開展TDM具有重要的臨床意義。

表3 利福噴丁血漿峰濃度（Cmax）測定值的分布Tab 3 Range distribution of Cmax about rifapentine in plasma

基于臨床需要，本文建立了一種簡便、快速測定血漿中利福噴丁濃度的HPLC-MS/MS法，可用于肺結核患者常規血藥濃度的監測。本研究結果表明，按單一劑量服用利福噴丁，血藥濃度的個體差異較大，因此對于服用利福噴丁的患者進行TDM具有更重要的臨床意義。筆者觀察到當利福噴丁血藥濃度在8.01 ～29.99 μg·mL-1時，在1個月內有77.50%（31/40）的患者臨床癥狀出現明顯改善，表現為咳嗽咳痰癥狀緩解，痰菌轉陰，病灶明顯吸收等；當利福噴丁血藥濃度≤ 8.00 μg·mL-1時，84.21%（16/19）的患者癥狀得不到有效的控制，當利福噴丁血藥濃度≥30 μg·mL-1時，75.00%（6/8）的患者出現了惡心、嘔吐、白細胞降低、皮疹等藥品不良反應。提示對利福噴丁進行TDM在肺結核的個體化治療中可能具有一定指導作用，但由于本研究樣本量較少，對于利福噴丁在肺結核治療中的最佳血藥濃度尚有待于收集大樣本病例進行更深入的分析。

[參考文獻]

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