MPTP誘導的食蟹猴偏側帕金森病模型運動行為學的長期動態評價研究

羅斌斌 胡亞松 岳 峰,2 陳 彪,2*

(1.廣西醫科大學基礎醫學院轉化醫學研究中心 長壽與老年相關疾病教育部重點實驗室，南寧 530000; 2.首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室，北京 100053)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于老年人的以肢體運動障礙為臨床特征的神經變性疾病[1-3]，全人群患病率大約在0.3%[4]，伴隨年齡的增加而發病率呈上升趨勢[2, 5]， 65歲以上人群患病率約是1～2%[3]。PD疾病發展表現出慢性進行性加重的特點[6]，主要病因和病理機制是在衰老、遺傳和環境因素共同作用下，中腦黑質致密部多巴胺能神經元進行性丟失引起黑質紋狀體多巴胺的下降[7]。

20世紀80年代中期研究者[8-9]發現化合物1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)轉變為毒性物質后可以透過血-腦脊液屏障，然后被多巴胺能神經元胞體攝取，聚集于線粒體后抑制呼吸鏈ATP合成，導致氧化應激損傷，進而引發多巴胺能神經細胞凋亡。MPTP是目前公認的可導致模擬人類PD癥狀的神經毒性的物質[10]。當前PD模型實驗大多來自于嚙齒類低等動物，高等動物模型較少[5-6, 11]，非人靈長類動物具有許多與人類高度相似的生理學特征，MPTP誘導建立的猴帕金森病模型具有典型代表性[12]，無論是臨床癥狀的變化,還是病理和生物化學指標的改變都與人類原發 PD 十分相似，是進行 PD模型研究中的“金標準”[13]。MPTP誘導的模型包括肌肉注射誘導的全身模型和頸內動脈注射誘導的偏側模型，前者運動癥狀明顯持續，但因生活無法自理，容易死亡，無法開展長期實驗，而后者可利用非受累側肢體取食，生活質量影響不大，但同時，運動癥狀變化能否持久相關研究較少。本課題組利用由研究者判斷的臨床評分和24 h軀體自發運動總量監測兩個指標評價頸內動脈注射MPTP誘導的偏側PD模型長期運動癥狀動態變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本次實驗動物由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司[以下簡稱靈康公司，SYXK(桂)2014-0004]提供，實驗室獲得國際實驗動物評估和認可委員會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care，AAALAC)認證。本研究實驗方案經實驗動物倫理委員會審核并批準實行(AAALAC：WD-0272009)，本研究在靈康公司靈長類動物實驗室進行，選取正常雄性食蟹猴(cynomolgus monkeys)作為本研究的實驗對象。動物環境溫度23～27 ℃，濕度40%～75%，12 h/12 h光暗交替(7點開燈，19點關燈)。動物早晚飼喂靈長類動物飼料[國家標準(GB)14924.8-2001]，午餐提供水果蔬菜， 24 h為動物提供不限量的經反滲透過濾后的安全飲用水。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑

軀體自發運動總量(physical activity monitoring，PAM)監測器(美國Mini Mitter公司)，便攜式錄像機(日本Sony公司)，MPTP(美國Sigma公司)。

1.2.2 MPTP誘導食蟹猴偏側帕金森病模型的建立

5只雄性食蟹猴年齡(5.80±0.44)歲，體質量(5.90±0.86)kg，術前禁食12 h以上，常規麻醉，氯胺酮(0.1 mL /kg)肌注，術中持續異氟烷1%～3%(體積分數)吸入麻醉。將裝有 60 mL 5%(質量分數)MPTP 溶液的注射器安裝在MPTP注射泵上，以4 mL/min的速度開始于食蟹猴左側頸總動脈末段注射 MPTP。MPTP 溶液注射(按照2 mg/kg體質質量)完畢后，逐層縫合頸闊肌、頸前筋膜、皮下組織及皮膚。

1.2.3 臨床評分

將動物轉移至錄像單籠，分別于MPTP注射前(基線)，注射后3、6個月及1、3、6年于清醒狀態下進行行為錄像1 h，通過結合Kulran(1991)非人靈長類動物帕金森病模型臨床評分量表[14]對錄像中表現出的臨床癥狀進行雙盲評分。評分內容包括：面部表情(0～3分)、靜止性震顫(0～3分)、動作性或意向性震顫(0～3分)、姿勢(0～2分)、步態(0～3分)、運動徐緩(全身)(0～4分)、平衡與協調(0～3分)、總體運動技能(上肢)(0～3分)、總體運動技能(下肢)(0～3分)、防御反應(0～2分)。最小分值為0分，即正常行為為0分，總分最高為29分，即最為嚴重。

1.2.4 軀體自發運動總量監測

軀體自發運動總量的監測主要包括：硬件設備中可以記錄運動數據的實時活動PAM監測器，數據發送、接收的專用讀取器ActiReader以及進行數據分析的Actical Software 3.0 軟件。將PAM監測器佩戴于動物頸部，監測時間點為MPTP注射前，注射后3、6個月及1、6年。每次佩戴結束后取下PAM監測器，利用ActiReader進行數據讀取，通過Actical Software 3.0 軟件進行數據分析和整理。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 MPTP誘導的食蟹猴偏側PD模型

結合Kulan 帕金森臨床評分量表[14]來評判MPTP誘導的偏側PD模型成功與否，造模前基線臨床評分均為0分，造模后3個月內臨床評分穩定在10 分以上可作為偏側PD模型成功構建的指標。對5只食蟹猴進行行為觀察，造模后2周開始出現精神萎靡、瞌睡、疲倦等急性期反應；4周開始出現PD臨床癥狀，主要有運動緩慢、右側肢體運動能力降低、屈曲身體以及攀爬能力下降，臨床癥狀隨時間不斷加重；第5周臨床評分>10分；3個月臨床評分(14.65±8.41)最高，出現明顯偏側PD運動障礙表現，包括總體活動減少，面部表情僵硬(面具臉)，運動徐緩，右上肢活動降低和右手震顫，右下肢運動減少，防御反應減弱，步態搖晃，身體平衡能力下降，以及不能進行攀爬，表明成功構建偏側PD模型。

2.2 食蟹猴偏側PD模型臨床評分的長期動態評價

與造模后3個月臨床評分(14.65±8.41)相比，造模后6個月(8.10±2.0)較基線仍明顯增高，但與3個月高峰相期相比顯著降低，造模后1年(7.15±1.48)、3年(4.65±1.01)、6年(4.90±1.94)均較3個月高峰期明顯下降，但與造模后6個月的評分相比，差異無統計學意義(圖1)，成模半年后臨床癥狀趨于平穩(5分左右)，并維持至少6年。時間累積對臨床評分的影響存在顯著性(F=5.930，P<0.005)。

分別針對評分量表中的震顫(tremor)、防御反應(defense reaction)、平衡(balance)、姿勢(posture)、步態(gait)、右上肢運動技能(right upper limb motor skills)、右下肢運動技能(right lower limb motor skills)、運動遲緩(bradykinesia)8個評分要素進行獨立分析，成模后臨床評分減低的先后順序依次為：震顫>防御反應>平衡>姿勢>步態>右下肢運動技能>右上肢運動技能>運動遲緩。這些癥狀均在3個月達到頂峰，隨后改善，其中震顫6個月時基本消失，而右側肢體的運動幅度和速度以及運動遲緩在造模后6年仍存在顯著障礙，防御反應、平衡、姿勢和步態改善較明顯(圖2)。

2.3 食蟹猴偏側PD模型軀體自發運動總量的變化

造模后3個月24 h軀體自發運動總量(16 597.79±12 488.87)較造模前基線(50 084.20±30 170.89)明顯降低(P=0.014)。造模后6個月24 h軀體自發運動總量(29 278.02±12 264.66)較3個月時有明顯恢復(P=0.016)，但仍顯著低于基線。造模后1年至6年24 h軀體自發運動總量變化與基線相比差異無統計學意義(圖3)。時間累積對24 h軀體自發運動總量的影響并不明顯(F=2.850，P>0.05)。

圖1 食蟹猴偏側PD模型造模前基線、造模后3、6個月及1、3、6年臨床評分的比較Fig.1 Comparing the clinical scores before and after the modeling of the hemi-Parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3, 6 months and 1, 3, and 6 years after modeling

圖2 食蟹猴偏側PD模型造模前基線、造模后3、6個月及1、3、6年臨床評分中各評分要素評分均值的變化Fig.2 Comparing the clinical scores before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgusmonkeys at 3, 6 months and 1, 3, and 6 years after modeling

圖3 食蟹猴偏側PD模型造模前基線、造模后3、6個月及1、6年全天24 h軀體自發運動總量的變化Fig.3 Comparing the 24 h physical activity before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3, 6 months and 1, 6 years after modeling

造模后3個月晝光(12 h)軀體自發運動總量 (14 814.19±12 707.49)較基線(45 743.90±28 587.57)下降明顯(P=0.014)。造模后6個月晝光(12 h)軀體自發運動總量仍較基線明顯降低(P=0.016)，但造模后1年至6年晝光(12 h)軀體自發運動總量變化與基線相比差異無統計學意義(圖4)。時間累積對晝光(12 h)軀體自發運動總量的影響并不明顯(F=2.850，P>0.05)。

圖4 食蟹猴偏側PD模型造模前基線、造模后3、6個月及1、6年晝光和夜光軀體自發運動總量的比較Fig.4 Comparing the physical activity in day-12 h andnight-12 h before and after the modeling of the hemi-parkinsonian’s model of cynomolgus monkeys at 3 months, 6 months and 1, and 6 years after modeling

造模后3個月夜光(12 h)軀體自發運動總量(1 783.61±676.08)較基線(4 340.30±2 464.01)顯著減少，差異有統計學意義(P=0.026)。造模后6個月夜光(12 h)軀體自發運動總量減少有明顯恢復，但仍較術前基線減少，差異有統計學意義(P=0.028)，造模后1年至6年夜光(12 h)軀體自發運動總量變化與基線相比差異無統計學意義(圖4)。長時間的累積對夜光(12 h)軀體自發運動總量有著顯著的影響(F=3.020，P<0.05)。

3 討論

在MPTP誘導靈長類動物PD模型猴的研究中，除Domino等[15]對PD模型猴進行3年的藥效研究和Emborg-Knott等[16]進行了6至8年的藥效與行為觀察，鮮有進行長期的運動行為學動態評價研究，尤其是偏側模型。相比影像學研究[17-19]和病理學研究[20-21]，本課題組首次結合臨床評分和軀體自發運動總量的監測，來評價臨床癥狀的發展變化，實現無創、經濟的靈長類PD模型運動行為學的長期動態研究。

本研究制備的MPTP誘導食蟹猴偏側PD模型注射后2周開始出現急性期非特異性全身反應，4周開始出現PD特異性運動癥狀，5周臨床評分已大于10分，表明成功構建PD模型[22]；3個月達到峰值，總分14左右，6個月分數降至8分左右，之后至6年后基本穩定在5分左右。從這些表現可以將該模型分為以下幾個階段：①急性期：MPTP注射至第4周，出現的全身癥狀反映了MPTP代謝物MPP+對外周器官和多巴胺神經元的損傷；②進展期：第4周至3個月，從開始出現運動癥狀到達到頂峰值，反映了黑質紋狀體多巴胺神經元變性死亡和多巴胺遞質的下降；③代償恢復期：第3個月至1年，從運動癥狀達到頂峰值后下降達到穩定階段(臨床評分)或完全恢復(24 h軀體自發運動總量)，反映了肢體或軀體逐漸適應了日常活動，源于動物體內存在自我補償機制[16]；④慢性期：1年到至少6年，軀體自發運動總量恢復正常，但受損對側肢體隨意活動仍然受到多巴胺神經元不可逆損傷的影響。

造模后3～6個月后最為明顯的變化是動物的受損側支配的上肢震顫得到了改善,其部分運動行為得到緩解，軀體自發運動基本恢復正常，表明動物體內的自身補償[16]，受損多巴胺能神經末梢得到代償，受損側紋狀體支配的右側上肢僅可偶爾表現出微弱取食的動作，這與模型穩定期動物右側上肢運動技能嚴重缺失不同[23-24]。由于左側紋狀體嚴重不可逆受損，食蟹猴依然保持穩定的旋轉行為，其支配的右側上肢隨意運動技能受限，以致動物傾向于使用左側上肢進行精細運動，這也可能與偏側性忽略病癥[25]有關。6年后食蟹猴運動徐緩是其臨床癥狀的主要表現，其中致病原因除多巴胺能神經元受到影響外，是否有路易小體及α-突觸核蛋白的參與[20]，則需要進一步研究。

造模后1年至6年間食蟹猴軀體自發運動總量與造模前基線數據差異無統計學意義，白天自發活動量改善最為明顯，夜間自發活動量也有改善趨勢。運動活動量為臨床表現的一種量化方式，食蟹猴臨床癥狀得到改善，6年后整體的活動量得以恢復并與基線無異。模型穩定期食蟹猴夜間運動活動量顯著下降，可能與夜間運動功能減退[26]有關，夜間運動功能減退是夜間帕金森病的表現，可能需要各種神經基質和途徑為其執行[27]，但是缺乏臨床病理的證明。有研究[28]顯示身體機能、平衡控制、運動障礙與身體的活動量存在呈正相關。

與肌肉注射MPTP所致雙側肢體受累模型猴不同，偏側模型6個月至1年之間的代償恢復期是雙側模型沒有的[29-30]，此階段不需要給予動物左旋多巴即可基本恢復正常自發活動。在此階段動物可通過非受損側肢體取食而維持基本正常日常活動，避免了較高的病死率且降低了飼養和照料成本；同時，偏側模型可用于研究機體的代償恢復機制。

本研究結果證實MPTP偏側猴模型可導致不可逆的紋狀體損害，引發持久的精細運動受損，可作為PD模型動物的長期動態和治療評價研究，為神經細胞修復、細胞移植等提供重要的參考價值。

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