衰老心肌中熱休克因子1的表達與線粒體損傷的關系

吳林果 劉 丹 武 燁 馬新亮 劉慧榮

(1.首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系， 北京 100069； 2.代謝紊亂相關心血管疾病北京市重點實驗室，北京 100069; 3.首都醫科大學燕京醫學院，北京 101300)

衰老是心血管疾病的主要危險因素之一，心血管疾病的發病率隨年齡的增高而增加[1]。因此了解心臟衰老的發生、發展機制，對降低老齡化導致的心血管疾病的發病率具有重要意義。

線粒體被認為是介導心肌細胞衰老的關鍵細胞器[2-3]。心肌細胞中含有豐富的線粒體，在細胞的功能維持方面起著關鍵的作用。線粒體通過形態及功能的改變[4]來進行自身的自我更新，有研究[5]表明，線粒體形態及功能的改變在心血管疾病中發揮著重要作用，但在衰老心臟中發揮的作用并不清楚。

熱休克因子(heat shock factor 1,HSF1)是熱休克蛋白的轉錄因子，在熱應激或者某些損傷刺激條件下可調控熱休克蛋白的表達，以提高機體在不良環境下的防御能力[6]。在衰老的大鼠骨骼肌中HSF1的表達增多[7]，同時也有研究[8]顯示在線粒體損傷之后可激活HSF1，從而促進肝癌細胞的侵襲。衰老伴隨著線粒體發生損傷，但在衰老的心肌中HSF1的表達是否發生變化，及與線粒體損傷之間是否存在一定的關系并不清楚，因此在本實驗中通過檢測衰老心肌中HSF1表達的變化，觀察衰老心肌中線粒體的形態及功能方面的改變，來明確衰老心肌中HSF1與損傷的線粒體功能之間的關系，為揭示心肌衰老的發生、發展機制及衰老相關心血管疾病的治療提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

根據小鼠和人的生命周期對比，年輕組(young)使用4月齡，老年組(aging)組使用24月齡SPF級成年雄性C57小鼠(C57BL/6)，實驗動物由愛爾麥特科技有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(蘇)2014-007。本實驗獲得了首都醫科大學動物保護協會的批準，并嚴格遵守首都醫科大學實驗動物的管理細則。

1.2 主要試劑與材料

H9C2心肌細胞系，購于協和醫科大學基礎醫學細胞中心。Anti-HSF1(#4356，美國CST公司)、 GAPDH抗體(#2118，美國CST公司)、 30%(體積分數)H2O2(KGF009，南京凱基生物)、山羊抗兔IgG/生物素標記(ZB-2301，北京中杉金橋公司)、山羊抗小鼠IgG/生物素標記(ZB-2305，北京中杉金橋公司)、戊二醛(50%體積分數)(G7651，美國Sigma公司)、胎牛血清(FNA500，上海依科賽生物公司)、DMEM高糖培養基(10817014,美國Corning公司)、線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006，上海碧云天生物技術有限公司)、ATP 含量測定試劑盒(A095-2，南京建成生物工程研究所)、增強型ATP 檢測試劑盒(S0027,上海碧云天生物技術有限公司)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定試劑盒(化學熒光法)(E004，南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器

酶標儀(美國Molecular Devices公司)； Western blotting電泳儀、Western blotting電轉儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；JEM-1400EX透射電子顯微鏡(日本電子公司)、激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 透射電鏡觀察心肌組織超微結構的改變

小鼠眼球取血處死后，快速剪取新鮮心臟的心尖部，在預冷的2.5%(體積分數)戊二醛中切割成0.5～1.0 mm3，4℃固定2～4 h,1%(體積分數)PB溶液洗3次，每次10 min，所有操作均在冰上進行。處理好的組織送電鏡室進行標本制備，所有操作均在冰上進行，用透射電子顯微鏡觀察心肌線粒體的結構改變。

1.5 細胞培養及給藥

用含有10%(體積分數)胎牛血清和1%(質量分數)青鏈霉素的DMEM高糖培養基培養H9C2細胞，置于37 ℃細胞培養箱中，待細胞密度達到90%時傳代至6孔板中繼續培養，當6孔板中細胞密度達到60%～80%時，給予200 μmol/L H2O2刺激4 h,之后更換為正常培養基培養48 h,進行后續相關實驗。

1.6 心肌組織及細胞中ROS的檢測

1.6.1 組織ROS檢測

稱取小鼠心肌組織，按1 g組織20 mL的比例加入緩沖液進行勻漿，1 000×g 離心10 min，取上清液，BCA法測濃度后加入1 mmol/L 2′,7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA) 的熒光探針，用酶標儀測其熒光強度。

1.6.2 細胞ROS檢測

在H2O2刺激后的H9C2心肌細胞中將 DCFH-DA探針加入培養基中，使其濃度達到10 μmol/L, 37 ℃孵育1 h,之后用PBS洗2次，加入0.25%(質量分數)胰酶消化，終止消化后 1 000×g 離心10 min收集細胞，PBS洗2次后進行熒光檢測。

1.7 心肌組織及細胞中ATP檢測

1.7.1 心肌組織中ATP的檢測

準確稱取小鼠的心肌組織，按照1 g組織9 mL沸水的比例加入沸雙蒸水，使其變成10%(質量分數)勻漿液，并置于沸水中水浴10 min，之后混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液進行檢測。

1.7.2 細胞中ATP含量的檢測

吸除細胞培養液，按照6孔板每孔加入200 μL裂解液裂解細胞。收集裂解液4℃ 12 000×g離心5 min，取上清，按照試劑盒操作說明配制ATP工作液和標準品，然后進行熒光檢測。

1.8 Western blotting法檢測心肌組織中相關蛋白表達

剪取適量的心肌組織，按照1 mg組織∶10 μL裂解液比例加入RIPA裂解液，提取心肌組織蛋白，BCA法測蛋白濃度，取30～50 μg的蛋白加入上樣緩沖液, 99 ℃變性8 min，SDS-PAGE凝膠電泳后采取濕轉方法轉膜，轉膜條件：400 mA，1 h。5%(質量分數)脫脂奶粉室溫封閉1 h，之后加入一抗4 ℃孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h, TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入化學發光試劑顯影。

1.9 JC-1 檢測H9C2 心肌細胞線粒體膜電勢

將細胞種至3.5cm細胞培養皿中，用H2O2刺激4 h后棄去培養基，用PBS清洗1次，加入1 mL完全培養基,之后在培養基中加入1 mL JC-1染色工作液混勻，放入細胞培養箱中37 ℃孵育20 min,在孵育期間，冰上配制1×JC-1染色緩沖液。37 ℃孵育結束后，棄上清，用1×JC-1染色緩沖液洗滌2次，之后加入2 mL高糖 DMEM 完全培養基在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.10統計學方法

2 結果

2.1 衰老小鼠心肌中線粒體形態及功能異常

利用透射電鏡對年輕小鼠和衰老小鼠心肌的線粒體結構進行觀察，結果顯示，與年輕組小鼠心肌的線粒體(圖1A)相比，衰老小鼠心肌的線粒體輪廓模糊，線粒體膜不完整，線粒體嵴排列紊亂(圖1B)，在衰老心肌中，心肌細胞中的線粒體結構出現異常。與4月齡的年輕小鼠相比，衰老小鼠心肌組織中ATP的含量降低(1.253±0.059vs0.479±0.122,P=0.012,圖1C)，而ROS的含量升高(0.853±0.096vs1.550±0.233，P=0.025，圖1D)，衰老的心肌中線粒體的氧化磷酸化功能出現異常。

圖1 衰老心肌中線粒體的結構及功能的改變Fig.1 Mitochondrial dysfunction in aging myocardium

2.2 衰老小鼠心肌中HSF1表達增高

與年輕組小鼠相比，衰老小鼠心肌組織中HSF1的表達明顯升高(0.980±0.112vs1.979±0.175，P=0.013)(圖2)。

2.3 衰老心肌中HSF1的表達與ATP含量相關性

對HSF1的蛋白水平與ATP及ROS含量進行了相關性分析，衰老小鼠鼠心肌組織中HSF1的蛋白水平與ATP的含量呈負相關(r=-0.977,P=0.005)，與ROS的含量呈正相關(r=0.934,P=0.020)。衰老心肌組織中表達增加的HSF1與線粒體的功能呈負相關(圖3)。

圖2 衰老心肌組織中HSF1的表達Fig.2 Expression of HSF1 in the myocardium

圖3 衰老小鼠心肌組織中HSF1的表達與ATP及ROS的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between the expression of HSF1 and the function of the mitochondria in aging heart

2.4 H2O2 刺激心肌細胞后線粒體發生損傷

在H2O2刺激后，H9C2心肌細胞的膜電位下降(圖4A)，同時檢測細胞中ATP及ROS含量的變化進一步觀察細胞線粒體的功能是否發生損傷，H2O2刺激H9C2細胞中ATP含量下降(1.012±0.071vs0.643±0.095,P=0.007)(圖4B)，ROS含量上升(1.035±0.046vs1.803±0.28,P=0.020)(圖4C)。H2O2刺激后線粒體發生了損傷。

2.5 線粒體損傷的H9C2心肌細胞中HSF1表達升高

在H2O2刺激后心肌細胞中HSF1的表達升高(1.550±0.180vs2.321±0.240,P=0.027)(圖5)，線粒體的損傷與HSF1的表達存在一定的關系。

3 討論

衰老是機體多個器官的生理功能隨著年齡的增長而逐步減退的過程，引起衰老的原因包括線粒體DNA(mtDNA)突變[9]、氧自由基損傷[10]、DNA損傷[11]等。心臟是重要的能量代謝器官，在心肌細胞中，線粒體體積約占心肌細胞總容積的1/3，并提供心肌所需的90%以上的能量[12]，在心臟功能維持方面起著重要的作用。不僅如此，線粒體還是自由基和ROS的主要來源，研究表明，當線粒體的損傷導致其功能發生紊亂時，可直接導致心肌氧化應激水平的升高[13]，而ROS是介導衰老相關細胞損傷的主要物質[14]，故而線粒體被認為是介導心肌細胞衰老的關鍵細胞器。而在本實驗中通過對心肌組織中線粒體的結構形態和功能變化進行觀察，發現在衰老心肌中線粒體形態結構異常，同時衰老心肌中ATP的含量下降，ROS的含量上升，與文獻研究[13-14]結果一致。

圖5 H2O2 刺激引起H9C2細胞中HSF1的表達升高Fig.5 Expression of HSF1 in H9C2 cells after H2O2 treatment compared with H9C2 cell

HSF1是熱休克蛋白以及應激蛋白的主要調控因子，參與細胞的分化、應激反應。有文獻[15]表明，HSF1可保護心肌細胞免受缺血/再灌注損傷，相關的熱休克蛋白也可發揮對心肌細胞的保護作用以此來對抗化療藥物的引起的心肌毒性損傷[16]，同時誘導熱休克反應還可減輕心房顫動[17]。也有研究[18]顯示在氟化物造成的急性損傷中 HSF1在心肌中的表達升高，HSF1還可通過阻斷Smad3的激活而作為一種新型的心肌纖維化負性調節劑來抵抗心肌纖維化[19]， 這些充分說明了HSF1在心臟疾病中發揮的重要作用。同時HSF1也參與衰老[20]、神經變性[21]、癌癥[22]等相關疾病，在維持細胞內平衡等方面發揮著十分重要的作用。

HSF1的降低可使DNA損傷誘導的細胞衰老[23]，衰老大鼠的骨骼肌中HSF1的表達升高，這些都提示HSF1參與衰老的進程。但是在衰老的心肌中HSF1的變化并不清楚，因此在本研究中對小鼠心肌組織中HSF1的表達進行了檢測，發現在衰老小鼠心肌中HSF1的表達升高，明確了HSF1在衰老心肌中表達的變化。有研究[24]顯示，心肌缺血再灌損傷、膿毒血癥等因素可誘導HSF1的產生，且在這些過程中均伴隨著ROS的增加，另有研究[25-26]顯示在肝癌細胞中ROS的產生可以使HSF1激活，這些都表明HSF1和ROS之間有密切的聯系。

為了進一步探究線粒體損傷與HSF1之間的關系，筆者用H2O2刺激H9C2細胞構建線粒體損傷的模型，并檢測相關指標評估線粒體的功能，JC-1 是一種線粒體定位的熒光染料，可以反映線粒體膜電位的變化，細胞在正常的情況下，JC-1 以紅色聚合體(JC-1 aggregates)的形式存在，當線粒體出現膜電位下降時，JC-1 可轉變為綠色單體(JC-1 monomer)。

在本實驗中也發現在衰老的心肌中線粒體發生損傷，同時心肌組織中ROS的生成增多，且與HSF1的表達呈正相關。所以本研究推測線粒體損傷過程中ROS的變化可能會引起HSF1表達的改變，在小鼠的心肌組織中檢測到了線粒體的損傷及ROS含量的升高，而H2O2作為氧化應激模型的常用藥物可以使ROS含量升高，使細胞線粒體發生損傷，因此本研究用H2O2刺激H9C2細胞構建線粒體損傷的細胞模型，通過檢測細胞中ATP及ROS的變化及線粒體膜電位的變化來評價線粒體的功能，結果顯示在線粒體損傷的心肌細胞模型中ATP含量下降，ROS含量上升，線粒體膜電位下降，隨后檢測HSF1表達的變化，結果顯示線粒體損傷后HSF1的表達升高，初步揭示在衰老的心肌中HSF1表達的變化與線粒體是損傷之間存在著一定的聯系。

以上研究結果表明，在衰老心肌中線粒體的形態和功能損傷，HSF1的表達升高，且與線粒體的功能呈負相關。本研究初步揭示了衰老心肌中HSF1表達與線粒體損傷的關系，為研究心肌衰老及線粒體損傷提供新的線索，同時也為衰老相關心血管疾病的治療提供了新的思路。

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