解毒藥與涼血藥配伍對咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠模型的干預作用

翟春艷 底婷婷 趙京霞 王 燕 解欣然 李 雪,3 蒙玉嬌,3 李寧飛,3劉正榮,3 張 璐 張 蕾 王 寧 李 萍*

(1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京100010; 2. 北京中醫醫院北京市中醫研究所 銀屑病中醫臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京100010; 3.北京中醫藥大學 北京中醫醫院，北京100027)

銀屑病是一種常見的以鱗屑、浸潤、紅斑為主要臨床表現的慢性炎性反應性皮膚病。中醫稱之為“白疕”，認為“內有蘊熱、郁于血分”是其基本病機，主張“從血論治”[1]，治法主要為“清熱涼血”，代表方劑為涼血湯。首都醫科大學附屬北京中醫醫院及北京市中醫研究所在此基礎上提出“血分蘊毒”的理論，認為血分蘊熱、由熱生毒、毒損血絡是銀屑病的重要病機，并提出優化方——涼血解毒湯。臨床研究[2]表明，涼血解毒湯在尋常型銀屑病的治療中效果良好，有效率為92.1%。但其作用機制尤其配伍解毒類中藥在其中發揮的作用尚不十分明確。

目前學術界普遍認為，不同亞群的T 淋巴細胞、樹突狀細胞以及中性粒細胞等在不同程度上參與了銀屑病的病理生理過程，而白細胞介素-23(interleukin-23，IL-23)/IL-17 軸在銀屑病的發病和病程進展中起關鍵作用[3-4]。因此，本實驗通過咪喹莫特誘導小鼠銀屑病樣皮損來觀察涼血解毒湯與涼血湯是否可以通過抑制IL-17、IL-23、IL-1β等相關細胞因子表達，從而起到治療銀屑病的作用，并進一步對比涼血解毒湯與涼血湯的各項指標，來探究解毒藥的配伍應用在銀屑病中的優勢及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

BALB/c雄性小鼠55只，由華阜康生物科技股份有限公司提供，體質量18～20 g。實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2013-0002。

1.2 藥物與試劑

涼血湯是首都醫科大學附屬北京中醫醫院協定處方，組成為生槐花15 g，生地黃15 g，赤芍10 g，丹皮10 g，白茅根30 g，防風10 g，白鮮皮10 g；涼血解毒湯是參考趙炳南老先生寶貴經驗并深入研究銀屑病的基礎上，形成的銀屑病優化方，組成為土茯苓30 g，紫草10 g，白花蛇舌草30 g，草河車9 g，板藍根15 g，生槐花15 g，生地黃15 g，赤芍10 g，丹皮10 g，白茅根30 g，防風10 g，白鮮皮10 g。中藥材統一由首都醫科大學附屬北京中醫醫院中藥房提供。按照成人標準體質量(60 kg)并根據人與動物間藥物劑量換算比例，計算小鼠灌胃所用的臨床等藥量，以中藥常規煎服法制備水煎劑。

咪喹莫特乳膏購自四川明欣藥業；凡士林購自河北蘭煉飛天石化；甲氨蝶呤片購自上海信誼藥廠；兔和鼠二步法檢測試劑盒，DAB顯色劑購自中杉金橋生物技術有限公司； 增生細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及CD3一抗工作液、生物素標記二抗工作液購自美國Abcam公司；TRNzol 總RNA 提取試劑購自天根生化科技有限公司; PrimeScriptTMRT reagent 試劑盒購自美國TaKaRa公司，IL-17、IL-23、IL-1β、Actin引物購自美國Invitrogen公司。

1.3 儀器與設備

獨立通氣籠具及配套飼養系統、高速冷凍離心機(Centrifuge 5415D)購自德國Eppendorf公司；-80 ℃冰箱、脫水機(ASP6025)、包埋機(EG1150)、石蠟切片機(RM2255)、烤片機(HI1220)、HE半自動染色儀(AUTOSTAINER XL)均購自德國Leica公司；恒溫水浴鍋、5%(體積分數)CO2恒溫培養箱、正置顯微鏡及圖像分析系統(IMAGER Z2)購自德國Zeiss公司；熒光定量PCR儀(ABI7500)購自美國Applied Biosystems公司。

1.4 模型制備及分組給藥

參考van der Fits等[5]銀屑病樣動物模型制備方法。將小鼠通過腹腔注射戊巴比妥鈉(80 mg/kg)進行麻醉，并將其背部約 2 cm×2 cm毛發剃除。采用數字表法隨機將備皮小鼠分為對照組、模型組、涼血湯組、涼血解毒湯組以及甲氨蝶呤組，于獨立通氣籠具中單籠飼養。對照組小鼠于備皮區每日涂抹凡士林42 mg,其余各組涂抹42 mg 5%(質量分數)咪喹莫特乳膏[1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并(4,5-C)喹啉-4-胺]；對照組與模型組小鼠每日1次0.2 mL 蒸餾水灌胃，涼血湯組與涼血解毒湯組給予等量的100%中藥溶液，甲氨蝶呤組給予等量1 mg/kg 甲氨蝶呤片溶液，持續至第7天。

1.5 檢測指標與方法

1)小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評分：于模型建立及治療期間，觀察各組小鼠皮損變化，并采用數碼相機拍照方式每日記錄；依據PASI評分標準，對鱗屑、浸潤及紅斑的嚴重程度進行評分,并計算總分，取平均值繪制趨勢線，以反映小鼠皮損的變化情況。

2)皮損表皮屏障功能檢測：分別于模型建立的第1、7天，采用皮膚水分油分測試筆，在一定溫度(20～25 ℃)、濕度(40%～60%)的環境中，對小鼠備皮區皮膚進行檢測。記錄其結果并分析。

3)皮損組織形態學觀察：于模型建立及治療第7天取材,將小鼠銀屑病樣皮損組織取下置于4%(質量分數)甲醛中，固定后使用儀器進行常規脫水、包埋及切片，將組織置于載玻片上固定并行HE染色。光鏡下觀察皮膚組織學改變并測量其表皮層厚度。采用GraphPad Prism 6軟件繪制皮損表皮層厚度柱狀圖，并結合SPSS 17.0統計分析。

4)皮損表皮基底層角質形成細胞的PCNA表達：取材及組織成片步驟同前，將組織脫蠟水化并高熱修復后，加3%(體積分數) H2O2滅活內源性過氧化物酶，PBS清洗，依次滴加血清封閉液、1∶100稀釋的PCNA一抗工作液、生物素標記二抗工作液，避光條件下DAB顯色，最后樹膠封片。光鏡下觀察各組小鼠皮損表皮基底層中PCNA陽性表達情況，并于400倍鏡下每組織隨機選取5個視野，計算其陽性比例并做出統計分析。

5)皮損真皮層中CD3陽性T細胞：取材、成片及免疫組織化學染色步驟同前，光鏡下觀察皮損真皮層中CD3陽性T細胞情況。并于400倍鏡下每組織隨機選取5個視野，計算其個數并做出統計分析。

6)皮損IL-17、IL-23及IL-1β mRNA的檢測：于模型建立及治療第7天取各組小鼠皮損，用TRIzol試劑提取組織mRNA，通過RT-PCR法進行實時熒光定量PCR檢測。采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析，進一步采用GraphPad Prism 6軟件繪制直方圖，并結合SPSS 17. 0統計分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 涼血解毒湯與涼血湯對咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠皮損的影響

觀察各組小鼠皮損變化，對照組小鼠背部皮膚始終光滑粉嫩，除頸部有少量褶皺外，無鱗屑、紅斑及浸潤現象；模型組小鼠皮膚從第2～3天開始出現浸潤褶皺及淡粉色斑點，并附有少量鱗屑，隨著時間的推移，皮損逐漸嚴重，直至第7天達到高峰，皮膚變厚變硬，鱗屑增多增厚呈片狀，脫落后多見篩狀出血點，紅斑由淡粉色變成暗紅色，并融合成凸起的斑塊，形成典型的銀屑病樣皮損。與模型組小鼠相比，涼血湯組、涼血解毒湯組及甲氨蝶呤組小鼠同期鱗屑浸潤紅斑癥狀明顯減輕，其中涼血解毒湯組小鼠的鱗屑浸潤癥狀總體較涼血湯組及甲氨蝶呤組改善明顯，詳見圖1。

依據PASI評分標準繪制趨勢線，直觀可見對照組小鼠浸潤、紅斑、鱗屑及總評分趨勢線始終保持在0左右，而其余各組小鼠分值不同程度持續升高，于第7天達到高峰；與模型組相比，甲氨蝶呤組、涼血湯組及涼血解毒湯組的鱗屑、浸潤、紅斑及總體評分均有所降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而涼血解毒湯組在鱗屑、浸潤方面作用更為顯著(P<0.01)，詳見圖2。

2.2 涼血湯與涼血解毒湯對咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠表皮屏障功能的影響

分別于第1天和第7天每組取8只小鼠檢測其皮膚的水分與油分含量，結果顯示與對照組比較第1天各組小鼠差異無統計學意義，治療7天后，模型組小鼠皮膚中水分、油分含量明顯較低；涼血解毒湯組小鼠皮損油分與水分含量較模型組有所改善；而甲氨蝶呤組與涼血湯組無明顯改變，詳見表1。

2.3 涼血解毒湯與涼血湯對咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠皮損組織形態學變化的影響

經HE染色，光鏡下觀察第7天各組小鼠皮損組織形態：對照組小鼠皮損表皮層相對較薄，真皮層較為緊密。模型組與其相比，表皮增生明顯并伴有角化不全，可見Munro微膿腫，形成銀屑病樣皮損。涼血湯組、涼血解毒湯組及甲氨蝶呤組較模型組有不同程度的緩解，其中涼血解毒湯組優于涼血湯組及甲氨蝶呤組,詳見圖3。

圖1 各組小鼠第7天皮損表現Fig.1 Gross observation of mice at day 7 of treatment

圖2 咪喹莫特誘導的各組小鼠1～7 d皮損PASI評分趨勢Fig.2 PASI scores of mouse skin lesions induced by imiquimod

表1 各組小鼠皮膚第7天油分與水分含量比較Tab.1 Comparison of oil and water component in skin lesions at day 7 after treating

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通過IPP測量表皮層的垂直厚度: 模型組表皮層較對照組明顯增厚約3～4倍，涼血湯組與涼血解毒湯組表皮層厚度較模型組降低(P<0.001)，差異有統計學意義，其中涼血解毒湯組優于涼血湯組，與甲氨蝶呤組相似，詳見圖4。

2.4 涼血湯與涼血解毒湯抑制咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠皮損中PCNA的表達

免疫組織化學染色法觀察各組小鼠表皮基底細胞的PCNA陽性表達：對照組小鼠表皮僅基底層細胞有增生跡象，約1～2 層，呈散在的點狀或連續的線狀排列; 與對照組相比，模型組在表皮層中細胞陽性表達增加異常明顯達5～6層；而與模型組相比，涼血解毒湯組表皮細胞增生有所降低，約2～3層，涼血湯組與甲氨蝶呤組相似，約3～4層，結果詳見圖5。

圖4 各組小鼠第7天表皮層厚度比較Fig.4 Comparison of epidermis thickness in skin lesions at day 7 of treatment

通過IPP測量表皮的PCNA陽性細胞百分比，每組小鼠各取6個標本，每個標本各取5個視野，結果顯示與前一致，詳見表2。

2.5 涼血湯與涼血解毒湯抑制咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠皮損中CD3+T細胞的浸潤

免疫組織化學染色法觀察各組小鼠真皮層CD3陽性T細胞:對照組小鼠皮膚真皮層中CD3+T細胞較少；模型組小鼠免疫組織化學染色可見表皮和真皮層均散在分布較多CD3+T細胞，與正常對照組小鼠相比，二者差異有統計學意義；涼血湯組、涼血解毒湯組及甲氨蝶呤組小鼠皮損組織中CD3+T細胞個數低于模型組，其中以涼血解毒湯組最為明顯，詳見圖6。

表2 各組小鼠第7天皮損表皮PCNA 陽性細胞百分比Tab.2 Comparisons of the percentages of PCNA positive cells

圖5 各組小鼠第7天皮損中PCNA表達Fig.5 PCNA expression of skin lesions at day 7 (immunohistochemical staining,400×)

通過IPP測量真皮層中的CD3陽性T細胞個數，每組小鼠各取6個標本，每個標本各取5個視野，結果顯示與前一致，詳見表3。

2.6 涼血湯與涼血解毒湯對咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠皮損中相關細胞因子表達的影響

經咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠皮損中IL-17 mRNA、IL-23 mRNA 及IL-1β mRNA的相對表達量均高于正常對照組，而涼血解毒湯可明顯抑制其表達，涼血湯僅對 IL-1β mRNA具有較明顯的抑制作用，對IL-17 mRNA及IL-23 mRNA相對表達量的影響與模型組相比差異無統計學意義,詳見圖7。

表3 各組小鼠第7天表皮皮損CD3陽性細胞個數Tab.3 Comparisons of the numbers of CD3-positive T cells

圖6 各組小鼠第7天皮損中CD3表達Fig.3 CD3 expression of skin lesions at day 7 (immunohistochemical staining, 400×)

圖7 各組小鼠第7天皮損中IL-17 mRNA、IL-23 mRNA及IL-1β mRNA相對表達量Fig.3 Comparisons of the expressions of IL-17 mRNA, IL-23 mRNA, IL-1β mRNA in skin lesions at day 7 after treating

3 討論

銀屑病是常見的慢性炎性反應增生性皮膚病，病程長、易復發[6]。在中醫臨床治療中以“清熱涼血”為主，其代表方劑涼血湯為北京中醫醫院趙炳南老先生的經驗方，方藥組成為生槐花、生地黃、赤芍、丹皮、白茅根、白鮮皮、防風等7味涼血中藥。北京中醫醫院在參考老先生寶貴經驗的同時，深入研究了銀屑病病機，協定增加土茯苓、紫草、白花蛇舌草、草河車及板藍根等5味解毒中藥，共同配伍形成銀屑病的優化方——涼血解毒湯。

本實驗結果顯示，涼血解毒湯與涼血湯均可降低皮損PASI評分及表皮厚度，同時降低PCNA陽性細胞百分比，減少CD3陽性細胞個數，并下調IL-1β mRNA相對表達量(P<0.05)，但涼血解毒湯在改善咪喹莫特誘導的銀屑病樣皮損、抑制角質形成細胞增生分化(5.66±0.057，P<0.01)以及減輕炎性浸潤(10.670±0.193，P<0.01)等方面，明顯較涼血湯更為優化，且在一定程度上還可改善皮膚屏障功能(水分16.980±2.739、油分7.750±1.209，P<0.05)，并抑制IL-17、IL-23 mRNA 在皮損中的表達(P<0.05),而涼血湯組小鼠皮損油分、水分含量及IL-17、IL-23 mRNA的相對表達量與模型組相比，差異均無統計學意義(P>0.05)。因此推測，涼血湯可通過抑制IL-1β mRNA的表達，進而減少炎性浸潤，改善咪喹莫特誘導的銀屑病樣炎性反應皮損；而涼血解毒湯可通過增加配伍解毒藥提升其在促進皮膚屏障功能恢復、抑制炎性浸潤等方面的干預作用，尤其對IL-23、IL-17 mRNA表達的抑制，能夠更好的改善鱗屑、浸潤及紅斑等咪喹莫特誘導的屑病樣皮損。

IL-23與IL-17是參與銀屑病發病機制的重要炎性反應因子。臨床上靶向IL-23 /IL-17 軸的全人源性和人源化單克隆抗體在治療中重度斑塊狀銀屑病及銀屑病性關節炎上療效顯著，應用IL-17拮抗劑secukinumab 治療中重度斑塊狀銀屑病[7],顯著療效達到PASI 90/100,并對PASI 75 有良好的維持療效[8]。那么解毒藥在銀屑病中的作用機制是否與其對IL-17、IL-23及IL-1β等相關炎性反應因子的抑制有內在聯系呢？

北京中醫醫院及北京市中醫研究所提出的“血分蘊毒”理論中，首次將“毒”分為外來之毒如細菌、病毒等，內生之毒如代謝廢物、炎性反應介質等，而銀屑病的病理學基礎與局部炎性反應有密切關系[9]，這提示的中藥解毒功效與現代醫學抗炎作用有內在聯系的推論與本實驗結果相吻合。現代研究[10]也證實了這個觀點，如本實驗用方中加減的5味中藥各自成分：白花蛇舌草主要成分白花蛇舌草總黃酮可通過核轉錄因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)和MAPK信號通路抑制脂多糖誘導的巨噬細胞中的炎性反應，同時可增強機體的免疫功能；土茯苓的主要成分落新婦苷可通過JAK3/STAT3信號通路抑制Th17細胞的分化，進而改善咪喹莫特誘導的銀屑病樣模型小鼠皮損[11]；板藍根提取液對多種炎性反應均有抗炎抑制作用，如二甲苯導致的小鼠耳腫脹，角叉菜膠導致的人鼠足跖腫和人鼠棉球肉芽組織增生，以及醋酸導致的小鼠毛細血管通透性增加等[12]；草河車提取物可顯著抑制丙酸桿菌[13];紫草主要成分紫草素可降低血清中Th17細胞相關炎性反應因子IL-17、IL-17F、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)、IL-6、IL-22等表達，從而改善銀屑病樣皮損及其組織病理變化[14];而其他常見的解毒類中藥如玄參，其主要化學成分Scropolioside A[15]不僅能通過抑制NF-κB 減少干擾素-γ、TNF-α以及IL-1β等炎性反應因子的表達，從而使T 細胞的周期停滯于S 期，最終使淋巴細胞的生理與病理作用減弱，還可有效降低環氧化酶-2與一氧化氮合成酶-2等促炎性反應酶表達，治療皮膚遲發型超敏反應。

綜上所述，解毒藥與涼血藥配伍可提升其對咪喹莫特誘導的銀屑病模型小鼠皮損的干預作用。涼血解毒湯在改善皮膚屏障功能，改善皮損組織形態變化、減緩表皮角質形成細胞增生、減少角化不全細胞及降低炎性浸潤程度等方面，明顯優于單純的涼血湯，而優勢藥物解毒類中藥的功效與抗炎作用有內在聯系，其在銀屑病治療中的作用靶點可能在IL-23、IL-17等相關炎性反應因子，因IL-23與IL-17是IL-23/IL-17炎性反應軸的重要參與者，因此對下一步解毒藥的具體作用機制的探討提供了思路，本研究結果不僅表明解毒藥在銀屑病的治療中發揮了至關重要的作用，并且反向為銀屑病“血分蘊毒”的病因病機理論提供了依據。然而對于解毒藥與涼血藥配伍是如何多靶點、多角度的通過調節免疫反應發揮治療銀屑病的機制[16]，仍有待于進行深入研究。

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