阻斷CD40-CD40L信號通路對小鼠肺移植術后閉塞性細支氣管炎的影響

陳榮卷 陳其瑞 許江南 丁躍中*

(1.首都醫科大學基礎醫學院免疫學系，北京 100069；2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院胸外科，北京 100020)

肺移植是許多肺部終末期疾病患者的最終治療方案，但患者術后存活率普遍低于其他實質性臟器移植手術[1]。限制肺移植長期生存的主要原因是術后閉塞性細支氣管炎(obliterative bronchiolitis，OB)的發生和持續進行的慢性排斥反應[2-3]。臨床研究[4]顯示白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)在OB的發展和肺移植術后排斥反應發生過程中起到了重要的作用，并且在動物模型中，利用抗IL-17A抗體中和IL-17A后可以有效減輕肺組織損傷和延長移植肺存活時間[4]。移植術后，IL-17A還可通過上調促炎因子如C-X-C模式趨化因子配體1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1]或 C-X-C模式趨化因子配體2[chemokine (C-X-C motif) ligand 2， CXCL2]參與中性粒細胞向移植肺的募集效應[5]。Th17細胞是IL-17A的重要來源細胞，由初始T細胞接受外來抗原或抗原呈遞細胞呈遞的抗原肽段刺激后分化發育而來。CD40-CD40L信號通路是激活T細胞的重要共刺激信號之一，CD40和CD40L的相互作用能夠刺激抗原提呈細胞，增強其他共刺激信號如B7的表達以及增加促進T細胞分化的細胞因子的合成[6]。抗CD40L抗體能夠有效阻斷CD40-CD40L信號通路，抑制初始T細胞向效應T細胞的活化過程，從而在器官移植中延緩移植排斥的進展，減輕移植排斥反應和提高移植耐受性[7-9]。雖然在小鼠肺移植模型中，抗CD40L抗體的應用減輕了小鼠移植肺的病理損傷[10]，但與傳統免疫抑制劑治療效果差異以及是否通過保護小氣道和抑制炎性因子的表達從而延緩OB的發生和進展尚不明確。因此，本研究在小鼠原位左肺移植模型的基礎上，研究注射抗CD40L抗體(MR1)后OB的進展、小氣道損傷和IL-17A mRNA表達水平的變化，并和注射傳統免疫抑制劑實驗組進行比較，進一步探索肺移植排斥及OB的發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組

無特定病原體級別(SPF級)雄性C57BL/6小鼠40只、SPF級雄性Balb/c小鼠30只，體質量24～28 g，均購買于北京維通利華技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。小鼠飼養于首都醫科大學實驗動物中心，實驗單位使用許可證號：SYXK(京)2015-0012。本實驗通過倫理審查(倫理編號：AEEI-2016-082)。將供受體按體質量采用抽簽法隨機配對分為4組(每組10只)，分別為假手術對照組C57BL/6；同種異型0.9%(質量分數)氯化鈉注射液(normal saline， NS)干預組Balb/c→C57BL/6; 同種異型環孢素/甲潑尼龍(cyclosporine/methylprednisolone， C/M)干預組Balb/c→C57BL/6；同種異型抗CD40L抗體(MR1)干預組Balb/c→C57BL/6。

1.1.2 主要試劑和儀器

試劑：環孢素/甲潑尼龍(Selleck公司，美國)；抗CD40L抗體 (Bio X Cell公司，美國)；抗髓過氧化物酶(Abcam公司，美國)；TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)；SYBR Green試劑盒(Qiagen公司，德國)；反轉錄試劑盒(NEB公司，德國)。儀器：光學顯微鏡(Leica DM6000 B，德國)；解剖顯微鏡(Olympus公司，美國)；Roter-Gene Q PCR儀(Qiagen 公司，德國)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原位左肺移植模型的構建

麻醉：使用2%(質量分數)戊巴比妥鈉按60 mg/kg劑量腹腔注射供體Balb/c小鼠。1)供體肺制取：將小鼠備皮消毒，連接呼吸機后，打開小鼠腹腔，將0.1 mL(100U/mL)肝素注入下腔靜脈。打開小鼠胸腔，剪開心耳和上腔靜脈，以預冷的肺泡灌洗液灌洗供體左肺。左肺取出后，暴露肺門結構，進行套管肺門的置入。動靜脈氣管套管置入后用0.9%(質量分數)氯化鈉注射液濕潤的無菌紗布覆蓋，低溫保存；2)受體操作：小鼠麻醉后備皮消毒，連接呼吸機，右側臥位。打開受體小鼠胸腔，暴露肺門結構。以10-0尼龍線阻斷動靜脈血流，將供體肺動靜脈氣管套管經受體動靜脈氣管切口插入，以尼龍線扎緊。松開阻斷血流的細線，使血流恢復。關閉胸腔和皮膚，皮膚切口處消毒處理，皮下注射抗生素。在呼吸機下觀察小鼠，直至自主呼吸恢復即可撤除呼吸機。

1.2.2 給藥及取材

假手術對照組、同種異型NS組與給藥組腹腔注射同體積的0.9%(質量分數)氯化鈉注射液；同種異型C/M組腹腔注射環孢素/甲潑尼龍，混合液環孢素劑量為10 mg·kg-1·d-1，甲潑尼龍劑量為1.6 mg·kg-1·d-1；同種異型MR1組注射同等劑量抗CD40L(克隆號：MR-1)抗體，25 mg·kg-1·d-1。各組給藥10次，分別于術前1 d、術前當天和術后每24 h給藥一次。術后10 d取小鼠移植左肺，進行指標檢測。

1.2.3 移植左肺組織中IL-17A mRNA表達水平檢測

肺移植術后10d，麻醉各組小鼠，獲取小鼠移植左肺。使用Trizol提取移植物中的總RNA，反轉錄為cDNA。使用SYBR Green法實時熒光定量PCR檢測IL-17A mRNA表達水平。實時熒光定量PCR循環設置條件為：預變性95 ℃ 2 min；變性95 ℃ 5 s；退火溫度60 ℃ 10 s；延伸溫度72 ℃ 30 s，共45個循環。引物序列詳見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers for RT-PCR

1.2.4 移植肺組織病理學檢測

肺移植術后10d，麻醉各組小鼠，獲取小鼠移植左肺。使用4%(質量分數)多聚甲醛固定肺組織，并將組織進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色、Masson染色以及利用抗髓過氧化物酶進行中性粒細胞組織化學染色。使用光學顯微鏡(Leica DM 6000B)觀察染色后組織學病理改變，并進行病理評分和中性粒細胞浸潤數量的統計。移植排斥病理評分等級為：0分=沒有明顯的炎性細胞浸潤；1分=炎性細胞浸潤支氣管旁和血管周圍；2分=炎性細胞浸潤肺間質；3分=炎性細胞浸潤肺泡；4分=炎性細胞浸潤支氣管腔內。纖維化病理評分參照早期Hübner等[11]的評分方式進行。中性粒細胞浸潤數目統計方式為：統計人員在2個不同時間段進行評分，每次統計10個視野。每個視野統計采用顯微鏡放大400倍下的圓形視野中的特異性染色的中性粒細胞個數。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 模型構建結果

經過前期小鼠移植模型構建的學習，實驗階段小鼠肺移植成功率在95%以上，小鼠術后呼吸通暢，進食和活動度良好，無明顯術后感染發生。術后10 d，犧牲小鼠收取移植左肺，相比假手術對照組，同種異型NS小鼠移植物明顯水腫和纖維化外觀，經傳統免疫抑制劑治療后小鼠左肺外觀上有所改善，而抗CD40L抗體治療組小鼠移植左肺改善較為明顯(圖1)。

圖1 移植術后第10天移植物大體圖Fig.1 Representative images of graft lungs harvested from grafts at 10th day

2.2 病理學分析

小鼠原位左肺移植術后10 d，相比于假手術組小鼠，在同種異型NS組小鼠病理學結果中可以觀察到典型且較重的炎性細胞浸潤和纖維化、OB現象以及小氣道損傷(P<0.01)。傳統免疫抑制劑環孢素/甲潑尼龍治療組病理結果與NS組比較，差異無統計學意義，病理評分差異無統計學意義。與傳統免疫抑制劑組比較，抗CD40L抗體治療組移植物中炎性細胞浸潤和纖維化以及OB都得到了明顯的改善，小氣道損傷減輕(P<0.05)(圖2、3、4)。假手術組中未見明顯中性粒細胞浸潤性染色，而同種異型NS組病理結果中可以觀察到明顯中性粒細胞浸潤(P<0.01)。與同種異型NS組相比，傳統免疫抑制劑治療后中性粒細胞浸潤有所減少，但差異無統計學意義，而抗CD40L抗體相比于傳統免疫抑制劑環孢素/甲潑尼龍效果顯著(P<0.01)(圖5、6)。

圖2 移植術后第10天移植物的HE染色Fig.2 HE staining of graft at 10th day after transplantation

圖3 移植術后第10天移植物的Masson染色Fig.3 Masson staining of graft at 10th day after transplantation

圖4 移植術后第10天移植物相關病理統計結果Fig.4 Pathology scores of lung grafts at 10th day

圖5 移植術后第10天移植物的中性粒細胞特異性染色Fig.5 Neutrophil staining with antimyeloperoxidase of graft at 10th day after transplantation

2.3 炎性細胞因子表達水平

術后10 d，小鼠抑制左肺組織中IL-17A mRNA表達水平檢測結果顯示，同種異型NS組較假手術對照組的IL-17A mRNA表達水平顯著增高(P<0.01)；而注射傳統免疫抑制劑后，IL-17A mRNA表達水平與NS組相比有所降低，但差異無統計學意義；抗CD40L抗體治療組移植物中IL-17A mRNA表達水平則低于傳統免疫抑制劑環孢素/甲潑尼龍(P<0.01)。實驗結果提示原位左肺移植模型中注射了抗CD40L抗體后可以有效降低移植肺中IL-17A的表達，且效果優于傳統免疫抑制劑環孢素/甲潑尼龍聯合注射(圖7)。

圖6 移植術后第10天移植物中性粒細胞統計結果Fig.6 Total number of neutrophils per high-power field of lung grafts at 10th day

圖7 移植術后第10天移植物中IL-17A表達Fig.7 The expression levels of IL-17A at 10th day after transplantation

3 討論

移植術后的慢性排斥和OB的發生是長期以來影響臨床患者肺移植術后長期生存的最主要因素[2]。早期肺移植相關研究受限于模型的構建，無法順利開展，隨著小鼠原位左肺移植模型的建立和不斷的完善，逐漸構建起了完整的小鼠移植模型體系，且能夠較好的模擬臨床肺移植過程，再現移植排斥和OB的發生[12-14]。本研究則采用小鼠原位左肺移植模型進行相關實驗。

研究[15]表明，T細胞和其相關細胞因子在移植排斥中發揮了重要的作用，但具體的機制仍不明確。初始T細胞識別外來抗原或抗原提呈細胞提呈的抗原后在共刺激分子如B7和CD28以及CD40L和CD40協同作用下，不斷分化發育成成熟T細胞，其中包括了IL-17A的重要來源細胞Th17細胞。CD40L多表達于激活的T細胞表面，而CD40多見于B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等。CD40和CD40L的相互作用能夠刺激抗原提呈細胞，增強共刺激信號B7，增加促進T細胞增生分化的細胞因子的合成，包括了IL-6、IL-8、IL-12、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等細胞因子，從早期實驗移植模型中觀察到阻斷該信號通路能夠建立移植受體對移植物長期的免疫耐受性后，便受到了廣泛的關注[16-19]。 抗CD40L抗體能夠競爭性結合該信號通路， 導致初始T細胞無法被正常激活，從而減輕移植物中Th17等炎性細胞的浸潤情況，因此被應用于多個移植模型研究中，且能夠有效減輕移植物排斥反應，延長生存時間[20-22]。本研究結果表明，與注射0.9%(質量分數)氯化鈉注射液和傳統免疫抑制劑環孢素/甲潑尼龍聯合治療組相比，抗CD40L抗體治療組受體小鼠移植左肺中移植排斥反應得到了較好的緩解；炎性細胞浸潤，纖維組織增生，小氣道損傷以及OB的發生情況都有明顯的減輕。

IL-17A是IL-17家族中的一員，臨床和動物研究[23-25]顯示，IL-17A密切參與了肺移植術后的排斥反應及OB發生過程。一項研究[4]顯示，通過向受體小鼠注射IL-17A中和抗體，能夠有效減輕排斥反應，延緩OB的發展，說明IL-17A在肺移植中發揮了重要的作用。有文獻[26]報道V型膠原參與了OB的病理發展過程以及肺部纖維化的病理過程，且和IL-17A表達水平關系密切。中和了IL-17A后V型膠原含量顯著降低，且在一定程度上減輕移植物的病理損傷[27]。臨床研究[28-30]顯示，移植排斥的發生伴隨著中性粒細胞浸潤和纖維化組織增生都與IL-17A大量表達有著密切關聯，IL-17A可以通過上調氣道上皮中促炎因子如CXCL1和CXCL2來募集中性粒細胞轉移向移植肺。纖維化的發生有著復雜且眾多類型細胞參與，其雖與IL-17A的表達水平相關，但具體的機制仍有待研究[31]。本研究結果顯示，注射了抗CD40L后，IL-17A表達水平顯著降低，與注射0.9%(質量分數)氯化鈉注射液組相比，抗CD40L抗體治療組抑制IL-17A表達效果強于環孢素/甲潑尼龍，且減輕了中性粒細胞的浸潤程度，這種緩解效應未在環孢素/甲潑尼龍干預組中發現。綜上所述，抗CD40L抗體可以有效降低移植肺中IL-17A表達水平，從而保護小氣道，減輕中性粒細胞的浸潤和纖維組織增生，延緩肺移植術后閉塞性細支氣管炎的發生，單用效果優于環孢素/甲潑尼龍聯合治療。然而其具體的作用機制，仍有待進一步深入研究。

致謝：本課題的順利完成還需感謝首都醫科大學免疫學系白力同學在實驗過程中給予的啟發和文稿修改上給出的合理建議。

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