玉屏風散加味方中“滌痰”“逐瘀”作用藥對對CO PD大鼠肺組織TG F-β1/Smad通路的影響*

席曉蓉，程 羽，羊忠山，趙文娟，潘晶晶，袁嘉麗

云南中醫學院，云南 昆明 650500

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種氣流受限、進行性發展的肺系慢性疾病[1-2]。氣道炎癥和氣道重塑是關鍵病變，也是導致患者肺功能及生活質量下降的根本原因[3-4]。轉化生長因子β1(TGF-β1)是COPD氣道重塑過程中重要的致纖維化細胞因子[5-6]，TGF-β1/Smad 信號轉導通路激活是氣道重塑發生發展的重要機制[7-9]。“滌痰”和“逐瘀”兩個作用藥對是在前期研究玉屏風散加味方全方基礎上進行的拆方研究。三七活血化瘀，對氣道重塑血瘀阻滯尤宜；莪術破血散瘀，既入血分，又入氣分。二者配伍，協同增效，行血而不傷血，散瘀而不傷正，組成“逐瘀”作用藥對；桑白皮、浙貝母、白芥子組成“滌痰”作用的藥對。本研究采用被動吸煙加氣管內注入脂多糖(LPS)的方法復制COPD大鼠模型，觀察有“滌痰”和“逐瘀”作用的兩個藥對對COPD大鼠肺組織TGF-β1/Smad信號轉導通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及用藥 雄性SPF級Wistar大鼠90只，體質量(200±20)g，由四川省達碩生物研究所提供，實驗動物合格證號：0017752。桑白皮15 g，浙貝母15 g，白芥子15 g組成“滌痰”作用藥對；三七9 g，莪術15 g組成“逐瘀”作用藥對，均購自云南鴻翔一心堂藥業集團股份有限公司。每克生藥加水8 mL煎藥3次后取藥汁，置于4℃冰箱中保存。灌胃前恢復到常溫后按比例稀釋使用。按成人每日治療劑量再根據大鼠體表面積換算為等效劑量，此劑量作為實驗藥物的低劑量，在此基礎上經濃縮獲得中、高劑量。藥物低、中、高劑量的比例為1∶5∶10。羅紅霉素(江蘇聯環藥業有限公司生產，批號：20141201)，調制成濃度為5.4 mg/mL備用。

1.2 試劑及儀器 脂多糖(LPS，美國Simga公司生產)；TGF-β1ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；Smad2/3、Smad7抗體(美國SATA CRUZ公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組 大鼠適應性飼養1周，將90只大鼠隨機分為正常組9只，其余81只為造模組。造模組于實驗第1、14天腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，固定于大鼠解剖臺上，暴露頸部，用碘消毒并用75%乙醇脫碘，按照大鼠頸部解剖結構，用1 mL注射器以水平方向15°斜刺入氣管，回抽判斷刺入后氣管內注入0.2 mL的LPS溶液，實驗第2～56天(注射LPS當天除外)上午將大鼠置于自制密閉有機玻璃箱內，注入紅塔山牌香煙煙霧，每次被動吸煙4支，持續30 min/d，制作COPD模型。正常組大鼠氣管內注入等量生理鹽水，不予煙熏。造模28天，正常組與造模組各處死1只大鼠，對比可見造模組支氣管管腔明顯狹窄，支氣管纖毛上皮細胞變性、壞死、脫落；支氣管周圍可見大量炎性細胞浸潤；肺泡結構紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴大，融合成肺大泡。將造模組剩余80只大鼠隨機分為模型組、羅紅霉素組及“滌痰”作用藥對低、中、高劑量組和“逐瘀”作用藥對低、中、高劑量組，每組10只。實驗第29天開始，“逐瘀”作用藥對高、中、低劑量組與“滌痰”作用藥對高、中、低劑量組及羅紅霉素組每日灌胃給藥1次，按體質量每200g灌胃2mL，連續給藥28天。正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。實驗期間模型組大鼠死亡2只，“滌痰”作用中劑量組死亡1只。

1.3.2 指標檢測 末次灌胃后24小時取材，無菌操作取肺組織制備肺組織勻漿，于4℃2 000～3 000 r/min離心機離心20分鐘后收集上清液，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測TGF-β1水平。取肺組織進行液氮研磨，收集組織粉末，加蛋白抽提緩沖液500 μL，離心取上清。將此樣品加入133 μL 4×SDS 上樣緩沖液，100℃3～5 分鐘，-80℃保存待用。二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量計算上樣量，將樣品加入預制的SDS-聚丙酰胺凝膠中電泳分離，采用水浴式電印跡將凝膠中的蛋白電轉移至硝酸纖維素濾膜(NC膜)上。將膜置于封閉液中過夜，加入一抗，室溫緩慢搖動2小時洗膜，加入二抗，室溫緩慢搖動1小時洗膜。而后細胞色素氧化酶二氨基聯苯胺(DAB)顯色、拍照分析，使用凝膠分析軟件測定各條帶的平均光密度值(OD值)，待測蛋白質表達量與β-actin表達量。

1.4 統計學方法 數據采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊用LSD-t檢驗，方差不齊用Dunnetts′s T 3檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 “滌痰”及“逐瘀”作用藥對對COPD大鼠肺組織TGF-β1的影響 模型組TGF-β1表達水平高于正常組(P＜0.05)；“滌痰”作用藥對低、中劑量組和“逐瘀”作用藥對低、中劑量組、羅紅霉素組較模型組大鼠TGF-β1表達水平降低(P＜0.05)，“滌痰”作用藥對和“逐瘀”作用藥對高劑量組TGF-β1表達水平與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1表達水平(±s) ng/L

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1表達水平(±s) ng/L

注：＊表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數 T G F-β 1正常組 8 1 4 1.6 6±1 5.8 4模型組 8 2 1 1.4 3±2 0.9 7＊羅紅霉素組 1 0 1 7 1.0 4±1 5.5 9#“滌痰”作用藥對低劑量組 1 0 1 6 8.5 5±1 9.3 3#“滌痰”作用藥對中劑量組 9 1 7 6.9 6±2 2.8 0#“滌痰”作用藥對高劑量組 1 0 2 0 3.2 1±1 8.5 2“逐瘀”作用藥對低劑量組 1 0 1 6 1.9 5±2 1.9 4#“逐瘀”作用藥對中劑量組 1 0 1 8 0.9 7±2 4.4 5#“逐瘀”作用藥對高劑量組 1 0 2 1 1.0 1±2 4.0 5

2.2 “滌痰”及“逐瘀”作用藥對對COPD大鼠肺組織Smad2/3、Smad7表達的影響 模型組Smad2/3水平較正常組升高(P＜0.05)；“滌痰”作用藥對低劑量組大鼠肺組織中Smad2/3表達低于模型組(P＜0.05)。羅紅霉素組、“滌痰”作用藥對高劑量組及“逐瘀”作用藥對低、中、高劑量組大鼠肺組織中Smad2/3表達高于模型組(P＜0.05)。模型組大鼠肺組織Smad7水平低于正常組(P＜0.05)；“滌痰”作用藥對高劑量組和“逐瘀”藥對低、中、高劑量組Smad7表達水平高于模型組(P＜0.05)。羅紅霉素組和“滌痰”作用藥對低、中劑量組大鼠肺組織中Smad7表達低于模型組(P＜0.05)，見圖1、表2。

圖1 各組大鼠肺組織Smad2/3、Smad7蛋白水平的表達

表2 各組大鼠Smad2/3、Smad7的蛋白表達水平(±s)

表2 各組大鼠Smad2/3、Smad7的蛋白表達水平(±s)

注：＊表示與正常組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別 S m a d 2/3 S m a d 7正常組 1.0 0 0±0.0 0 0 1.0 0 0±0.0 0 0模型組 1.2 2 5±0.2 8 8＊ 0.7 7 3±0.0 0 2＊羅紅霉素組 2.0 1 0±0.0 4 4#0.2 0 0±0.0 1 3#“滌痰”作用藥對低劑量組 0.9 1 0±0.0 1 0#0.8 3 0±0.0 0 7“滌痰”作用藥對中劑量組 1.2 0 4±0.0 0 3 0.8 4 6±0.0 1 9“滌痰”作用藥對高劑量組 1.6 5 4±0.0 3 8 1.1 2 0±0.0 1 1#“逐瘀”作用藥對低劑量組 2.4 0 1±0.0 2 5 1.2 4 3±0.0 1 8#“逐瘀”作用藥對中劑量組 2.3 4 7±0.0 6 6 1.1 7 7±0.0 1 2#“逐瘀”作用藥對高劑量組 2.6 6 6±0.0 8 3 1.0 5 1±0.0 0 9#

3 討論

COPD的發生、發展與氣道重塑密切相關，成纖維細胞與杯狀細胞增生、膠原與氨基聚糖沉積、黏液腺增生肥大均與COPD重塑相關，而TGF-β1參與并調節了這些病理過程[10-11]。Smad2、Smad3 是受體調節型Smads蛋白，為TGF-β1下游調節因子，當TGF-β1與其受體TβR-Ⅱ、TβR-I結合形成復合物，通過磷酸化Smad2/3將信號從胞漿傳遞入胞核激活轉錄，促進肺病變。Smad7是抑制型Smads蛋白，在TGF-β1/Smads信號傳導通路中起負反饋作用，Smad7表達不足，不能抑制Smads信號轉錄，從而失去對肺部病變的抑制作用，導致肺功能降低[4]。因此，抑制TGF-β1的產生或(和)活性，拮抗或阻斷TGF-β1/Smads信號途徑可減緩COPD氣道重塑的進展[12-13]。

玉屏風散加味方基于COPD氣道重塑“肺氣虛衰，痰瘀互結”的病機特點，以“益肺散結”為治則組方而成。黃芪、白術、防風扶正補氣益肺；桑白皮、浙貝母、白芥子平喘滌痰散結；生三七、莪術活血逐瘀散結。本研究將全方進行拆方，組成“滌痰”作用和“逐瘀”作用藥對，用被動吸煙加氣管內注入LPS的方法復制COPD大鼠模型，發現模型大鼠TGF-β1、Smad2/3 表達上調，而 Smad7 表達下調。“滌痰”作用藥對低劑量治療后，肺組織TGF-β1、Smad2/3表達下調；“逐瘀”作用藥對低、中劑量治療后，肺組織TGF-β1表達下調，Smad7表達上調。提示“滌痰”“逐瘀”作用藥對可能通過干預TGF-β1/Smads信號轉導通路抑制TGF-β1信號的細胞內轉導，起到阻斷COPD氣道重塑的作用。

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