K亞群禽白血病病毒5′LTR序列及啟動活性分析

趙子君，饒明章，陳 建，張 杰，袁麗霞，廖 明，曹偉勝

(華南農業大學獸醫學院，農業部獸用疫苗創制重點實驗室，廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣州 510642)

禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALVs)屬于反轉錄病毒科、α反轉錄病毒屬，是一類能夠引起禽類多種腫瘤性疾病的病毒群，對養禽生產危害巨大。根據宿主范圍、囊膜蛋白抗原性和交叉中和反應等，將其分為A～K共11個亞群，其中A～D、J和K亞群為外源性ALV，而 C、D亞群在野外極為少見[1]；E～I 亞群為內源性 ALV，其中 E 亞群為整合在雞染色體中一種前病毒 DNA，在雞群中普遍存在，而 F～I 亞群主要感染野生禽類，包括雉、鷓鴣和鵪鶉等[2]。

K亞群禽白血病病毒(ALV-K)是2012年王鑫等[3-4]首次從我國地方品種蘆花雞中分離到的新亞群，隨后，2014年郝建勇等[5]、2016年X.J.Li等[6]以及2017年H. X. Shao等[7]在我國地方雞群中也分離到ALV-K。將這些新分離的ALV-K LTR部分與其余已知亞群LTR進行序列比對分析發現，除了王鑫等[3-4]分離到的ALV-K LTR部分屬于外源性ALV外，其余地方分離到的ALV-K LTR部分均屬于內源性ALV。值得注意的是，這種LTR為內源性的ALV-K毒株與我國臺灣地區發生的神經膠質瘤突變株TW3539[8]高度相似，并且我國臺灣地區的研究報道認為LTR為內源性的ALV-K在臺灣地區很常見[8]。目前，本課題組還分離到14株LTR為內源性的ALV-K毒株，推測LTR是內源性的ALV-K毒株可能一直存在于我國地方品種雞中。

ALV前病毒基因組結構中含兩段長末端重復序列(5′LTR和3′LTR)，包括R區、U5區和U3區，負責控制病毒基因的轉錄，不編碼蛋白質，其中5′LTR是ALV基因表達的調控中心，與病毒復制、 翻譯、 致瘤等密切相關。內源性和外源性ALV具有相同的結構特征，但LTR部分差異較大。張青嬋[9]研究發現帶有內源性LTR的ALV在DF-1細胞上的復制顯著低于帶有外源性LTR的ALV，病毒滴度可相差100倍，其推測ALV基因組中的LTR序列與ALV在細胞上的復制水平以及致病性有關，但未對LTR的啟動活性作進一步探究。

本研究以源于廣東某黃羽祖代種雞場健康雞群中分離到的ALV-K毒株(GDFX0601)作為研究對象，比較分析了其5′LTR核苷酸序列，并評估了ALV-K(GDFX0601)在DF-1細胞上的復制能力，且分別在DF-1、CEF和293T細胞上評估了不同亞群ALV毒株5′LTR的啟動活性差異。

1 材料與方法

1.1 載體、細胞和質粒

pGL3-Basic、pGL3-Control和pRL-TK海腎熒光素酶載體購自美國Promega公司。DF-1細胞、CEF細胞、293T細胞和ALV-K毒株(GDFX0601)、ALV-A毒株(GD13)、ALV-B毒株(CD08)和ALV-J毒株(CHN06)均由農業部獸用疫苗創制重點實驗室提供。

1.2 LTR片段的擴增與序列分析

ALV-K毒株(GDFX0601)和ALV-J毒株(CHN06)前病毒DNA為模板進行PCR擴增，反應條件：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物通過瓊脂糖凝膠電泳和回收后，分別克隆至pMD18-T載體中，陽性重組質粒送至上海Invitrogen公司進行測序。測序結果用生物學軟件DNAStar7.1及在線軟件TFSEARCH進行序列相似性分析和細胞轉錄因子結合位點分析。

1.3 ALV-K(GDFX0601)在DF-1細胞上的復制

將ALV-K毒株(GDFX0601)、ALV-A毒株(GD13)、ALV-B毒株(CD08)和ALV-J毒株(CHN06)，以每孔接種100 μL毒液(103.5TCID50)，分別接種24孔細胞培養板中，5% CO2、10% FBS、37 ℃培養箱中培養。待接種毒液后第2天，細胞長滿單層后，換為1% FBS的細胞維持液進行培養。連續培養7 d，期間持續監測細胞的生長情況，收集1～7 d的細胞上清液用IDEXX公司的Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit進行檢測，使用前試劑盒中所有試劑(包括包被板)應回溫2 h以上，使其恢復至室溫(18～25 ℃)，試劑及凍融樣品在使用前應輕輕振搖徹底混勻。

1.4 重組質粒的構建

重組質粒pGL3-Basic-GDFX0601-LTR、pGL3-Basic-CHN06-LTR、pGL3-Basic-ev-1-LTR、pGL3-Basic-JS11C1-LTR的構建。將ALV-K(GDFX0601)、ALV-J、ALV-E和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1) LTR的PCR產物和不含啟動子的螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic分別用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后回收。將雙酶切后的LTR回收產物分別與pGL3-Basic進行連接，重組質粒經初步鑒定正確后送廣州艾基生物技術有限公司測序驗證。

1.5 重組質粒的轉染

用OMEGA去內毒素質粒提取試劑盒抽提pGL3-Basic-GDFX0601-LTR、pGL3-Basic-CHN06-LTR、pGL3-Basic-ev-1-LTR、pGL3-Basic-JS11C1-LTR質粒。消化前期準備的DF-1細胞、CEF細胞和293T細胞，鋪24孔細胞培養板，10% FBS，5% CO2、37 ℃培養。24 h內進行轉染，Corning公司24孔 細胞培養板每孔轉染體系為：1 μg質粒(900 ng重組質粒和100 ng 海腎熒光素酶內參質粒)和2.5 μL POLOdeliverer 3000分別用50 μL Opti-MEM?稀釋并孵育5 min，然后再混合，共同孵育15 min，將100 μL質粒-脂質體復合物加入到準備好的24孔細胞培養皿中。按照上海銳賽POLOdeliverer 3000轉染試劑盒操作說明進行轉染。

1.6 熒光素酶的檢測

轉染后的細胞，培養48 h后，按Promega雙熒光檢測試劑盒(Dual -Luciferase?Reporter Assay System)說明書操作進行熒光素酶的檢測。主要步驟有用細胞裂解緩沖液裂解細胞，檢測螢火蟲熒光信號和海腎熒光信號，二者比值即為重組質粒啟動活性。

2 結 果

2.1 LTR相似性及轉錄結合位點分析

利用DNAStar7.1基因分析軟件對ALV-K(GDFX0601)毒株的LTR基因核苷酸序列與GenBank中已公開發表的國內外各參考毒株的LTR基因核苷酸序列進行相似性分析，發現外源性ALV LTR的大小在325 bp左右，內源性ALV LTR的大小在274 bp左右，ALV-J國外參考株(HPRS103)的LTR長度為325 bp，其中U3為224 bp，R為21 bp，U5為80 bp。經典外源性ALV-A、ALV-B和ALV-J之間LTR的相似性在80%左右，與內源性ALV-E LTR的相似性最高只有70%左右。將本課題組分離到的ALV-K(GDFX0601)毒株進行相似性分析，發現其LTR與ALV-E相似性高達98.5%，與外源性ALV相似性只有70%(圖1)，與已報道的臺灣株(TW3539)相似性達99%(圖1)。

上三角表示相似性，下三角表示分歧度Data in upper-triangle is percent indentity, data in lower-triangle is divergence圖1 ALV-K(GDFX0601)與不同亞群ALV參考株LTR基因核苷酸序列相似性分析Fig.1 The homology of nucleotide sequences of LTR of subgroup K ALV isolates and other reference strains

2.2 LTR轉錄因子結合位點分析

ALV-K (GDFX0601) LTR與其他參考毒株相比R區域與所有參考毒株相似性較高，U5區域和外源性病毒有83.3% ～93.6%的相似性，相似性也較高，而包括CArG box、Y box、PRE box、CAAT box和 TATA box 等轉錄調節元件的U3 區域與外源性病毒差異較大，其中CAAT box、CArG box和TATA box均有堿基突變(圖2)。ALV-K (GDFX0601) LTR U3 區域的轉錄調節元件和ALV-E一致，相對保守(圖2)。

2.3 ALV-K(GDFX0601)在DF-1細胞上的復制動力學

將ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K(GDFX0601)接種DF-1細胞培養，連續7 d取細胞培養上清ELISA檢測p27抗原，檢測結果顯示：ALV-K(GDFX0601)在DF-1細胞上的增殖能力顯著低于ALV-A、ALV-B和ALV-J (P<0.05，圖3)。這表明ALV-K(GDFX0601)在細胞上的復制速度與其感染能力弱于ALV-A、ALV-B和ALV-J。

箭頭表示U3區、R區和U5區劃分；·代表堿基相同，而字母代表堿基突變；-代表堿基缺失；方框代表不同的轉錄調節元件The arrows indicate the division of the U3, R and U5 zones; Dots (·) indicate identical residues, while letters indicate base substitutions. Dashes (-) indicate gaps in the alignment. Locations of putative transcriptional regulatory elements are indicated in boxes and are marked圖2 ALV LTR各區域核苷酸序列及轉錄因子結合位點分析Fig.2 Nucleotide sequence alignments and motifs of the ALV LTR region

圖3 ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K在DF-1細胞中復制Fig.3 Replication of the ALV-A, ALV-B, ALV-J, and ALV-K in DF-1 cells

2.4 在DF-1上各毒株LTR啟動活性的比較

在DF-1細胞上轉染ALV-K(GDFX0601)LTR、 ALV-J(HN06)LTR、ALV-E (ev-1) LTR和ALV-K(JS11C1)LTR含熒光素酶報告基因重組質粒，結果顯示ALV-K(GDFX0601)LTR重組質粒的熒光素酶的平均相對表達量均低于ALV-J(CHN06)LTR和王鑫等[3]分離到的LTR為外源性的ALV-K (JS11C1)LTR重組質粒，但高于ALV-E (ev-1) LTR(圖4)。

圖4 含不同LTR重組質粒在DF-1細胞的熒光素酶啟動活性分析Fig.4 Luciferase activity analysis of DF-1 cells with different LTR recombinant plasmids

2.5 在CEF上各毒株LTR啟動活性的比較

由于ALV-K(GDFX0601)的LTR部分屬于內源性ALV，本研究又在可感染ALV-E 的CEF細胞上進行試驗，試驗結果與在DF-1細胞上一致(圖5)，說明ALV-K(GDFX0601)毒株LTR的啟動活性比ALV-J和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1)毒株LTR的啟動活性弱。

圖5 含不同LTR重組質粒在CEF細胞的熒光素酶啟動活性分析Fig.5 Luciferase activity analysis of CEF cells with different LTR recombinant plasmids

2.6 在293T上各毒株LTR啟動活性的比較

本研究同時在293T細胞上進行試驗，結果發現轉染含ALV-K(GDFX0601)LTR重組質粒的熒光素酶的平均相對表達量也均低于轉染ALV-J(CHN06)LTR和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1)LTR重組質粒，但高于轉染內源性ALV(ev-1)LTR(圖6)。結果再次說明LTR屬于內源性毒株的ALV-K(GDFX0601)的LTR的啟動活性比外源性ALV-J毒株和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1)毒株的LTR的啟動活性弱。

圖6 含不同LTR重組質粒在293T細胞的熒光素酶啟動活性分析Fig.6 Luciferase activity analysis of 293T cells with different LTR recombinant plasmids

3 討 論

近幾年來，ALV在我國流行情況依然嚴重，不同亞群ALV感染我國地方品系雞均有相關報道，包括ALV-A、B、E、J、K[3,10-12]。中國作為養禽大國，養殖數量大、品種多、養殖場分散，使得ALV的凈化和防控難以有效實施，加上禽白血病可通過垂直傳播，嚴重影響雛雞的質量，還可引起雞群直接發病而死亡或使感染雞群產生免疫抑制而繼發其他疾病，從而降低疫苗免疫應答效果，影響雞的生產性能[13-15]，給養殖業造成了巨大的損失。在外源性ALV中，以ALV-A、ALV-B和ALV-J為主，對養禽生產的危害較大[13]。2012年，王鑫等[3-4]從我國蘆花雞中分離到3株毒株，鑒于其gp85基因不同于其他各已知亞群，故將其命名為ALV-K；隨后，2014年郝建勇等[5]和2016年X.J.Li等[6]從廣東地方品系雞中、2017年H. X. Shao等[7]從江蘇也分離到該亞群病毒，ALV-K在我國地方種雞中逐漸流行起來。2017年從山東地區肉雞中鑒定到一株ALV-K并完成其全基因組序列分析[16]。值得注意的是，2014年后分離到的ALV-K 其LTR部分均屬于內源性ALV，大小與內源性病毒相近，而王鑫等[3]分離到的ALV-K的LTR大小與外源性病毒相近。

ALV基因組結構主要由5′LTR-gag-pol-env-LTR3′組成，長末端重復序列LTR不編碼蛋白質，分別由3′獨特區U3、 短重復區R 及 5′獨特區U5 3部分組成。ALV的LTR與病毒復制、 翻譯、 致瘤等密切相關[17]。5′LTR是反轉錄病毒基因表達的調控中心。ALV-K作為新的亞群，近些年在我國很多地方品系雞中被分離到[3, 5-7]，但有關其生物學特性的研究報道相對較少，本研究以LTR為內源性的ALV-K(GDFX0601)毒株為研究對象，感染DF-1細胞并將其LTR部分克隆進pGL3-Basic載體。對LTR基因核苷酸序列進行相似性分析，發現ALV-K(GDFX0601)LTR部分大小只有274 bp，與內源性ALV LTR相似性大于98.5%，而與外源性ALV LTR相似性小于72.5%；LTR區的U3是強轉錄調控單位，決定LTR啟動活性強弱，序列分析結果顯示ALV-K(GDFX0601)U3區的轉錄調節元件與其他外源性ALV差異較大，與內源性ALV相似性較高。本研究進一步將ALV-K(GDFX0601)接種DF-1細胞，發現LTR為內源性的ALV-K(GDFX0601)在細胞上的復制速度較LTR為外源性毒株慢，這與張青嬋[9]將LTR為內源性及外源性的ALV-A同時接種DF-1細胞的研究結果一致，LTR為內源性的毒株在DF-1細胞上復制更慢，病毒滴度更低。由于LTR為內源性的毒株復制速度慢，可致p27抗原表達水平低，易使ELISA方法漏檢已感染這類外源性病毒的雞，從而造成廣泛傳播，這應該引起足夠的重視。根據研究結果推測ALV-K(GDFX0601)的復制能力低可能與其5′LTR基因密切相關。

本課題組張賀楠等[18]在體外細胞水平分析顯示不同病變型ALV-J國內分離株LTR之間的啟動活性差異不顯著，之后本課題組馮少珍等[19]研究發現ALV-J LTR啟動活性高于ALV-A和ALV-B，但其并未報道ALV-E LTR的啟動活性。因此，本研究選擇ALV-J (CHN06)、ALV-E (ev-1)、ALV-K (GDFX0601)和LTR為外源性的ALV-K (JS11C1) 5′LTR作為研究對象，分析LTR啟動活性差異，為了避免重復，本研究沒有選擇ALV-A和ALV-B LTR。pGL3-Basic載體缺少啟動子序列，但有熒光素酶報告系統，將LTR序列插入pGL3-Basic載體，可以通過檢測熒光素酶活性，反映LTR啟動活性的強弱；pGL3-Control載體具有啟動子序列，能啟動熒光素酶的表達，作為對照；PRL海腎熒光素酶載體為內參。5′LTR的啟動活性試驗結果發現ALV-K(GDFX0601) LTR的啟動活性比ALV-J(HN06)和LTR為外源性的ALV-K(JS11C1)的啟動活性弱。由于LTR為內源性的ALV-K啟動活性弱，而導致其復制能力低，使得ELISA檢測血漿或者泄殖腔樣本時漏檢。目前我國地方品系雞群中分離到的LTR為內源性的ALV-K，究竟是王鑫等[3]分離到的ALV-K毒株在凈化演變過程中與內源性病毒發生了重組，還是內源性病毒與外源性病毒發生重組從而產生LTR屬于外源性的ALV-K毒株，即ALV-K本身LTR是內源性還是外源性還有待進一步探究。

4 結 論

大部分反轉錄病毒LTR序列不僅具有真核生物啟動活性，而且具有原核細胞啟動活性，目前鮮有對ALV-K 5′LTR啟動活性研究的報道。本研究驗證了LTR屬于內源性的ALV-K(GDFX0601)的 5′LTR啟動活性低于5′LTR屬于外源性的ALV毒株(P<0.05)，這可能是ALV-K(GDFX0601)復制能力和致病性弱的原因。同時試驗結果顯示轉染ALV-K (GDFX0601)毒株LTR啟動活性高于轉染ALV-E(ev-1)毒株LTR，究其LTR屬于內源性毒株的ALV-K (GDFX0601)LTR比內源性毒株LTR啟動活性高的原因，推測與LTR U3區堿基的突變有關。本研究也為進一步研究內源性ALV LTR調控病毒復制的機制奠定了基礎。

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