豬丁型冠狀病毒與豬流行性腹瀉病毒雙重實時熒光定量RT-PCR方法的建立和初步應用

羅尚星，范京惠*，劉寶京，師乾凱，侯林杉，左玉柱,2*

(1. 河北農業大學動物醫學院，保定 071001；2. 河北農業大學動物科技學院，保定 071001)

豬丁型冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)屬冠狀病毒屬，是一種以腹瀉、脫水為臨床癥狀的豬腸道傳染病，各年齡段的豬均易感，其中新生仔豬最易發病[1]。本病于2012年首次于我國香港發現，2014年于美國大面積暴發，后在韓國、加拿大均檢出此病毒[2-4]。國內一些學者研究發現PDCoV的感染率為20%～30%，個別地區高達40%[5-7]，使豬場腹瀉形勢更加嚴峻。豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是目前我國引起仔豬腹瀉的主要病原，自1976年傳至我國以來，給養豬業造成了嚴重的效益損失，2010年由于PEDV流行毒株的變異，導致中國南方十余個省份上億頭仔豬死亡[8-9]。由于感染PDCoV的動物臨床癥狀與感染PEDV的動物臨床癥狀相似，且PDCoV常與PDEV等發生混合感染，導致確診困難，因此，建立一種快速、準確而又靈敏的檢測手段對于仔豬腹瀉病的確診、監控及分子流行病學調查等均具有重要意義。

目前用于PDCoV和PEDV檢測RT-PCR方法較多，有單一RT-PCR也有多聯RT-PCR的方法，但無論PDCoV還是PEDV，一旦發病，腸道內的病原數量不穩定，常規RT-PCR有可能由于敏感性低出現較高的假陰性較多，并且不能進行準確的定量，且由于后續需要電泳才能觀察結果，存在安全問題；熒光定量RT-PCR檢測方法因具有快速，簡便，安全，靈敏度高，且可定量等優點，是一種更適用于臨床檢測的檢測方法。

本研究根據PDCoV和PEDV的保守基因序列設計了兩對特異性引物，分別擴增其保守區基因并將其克隆至pMD19-T載體，以梯度稀釋的混合重組質粒為標準品，利用SYBR Green I染料的非特異性與PDCoV和PEDV的cDNA分別進行結合，并利用RT-PCR中擴增片段的Tm值的不同進行核酸片段的區分，構建了檢測PDCoV和PEDV的雙重熒光定量RT-PCR方法。為仔豬腹瀉病的診斷及分子流行病學調查提供了一種快速、定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒

豬丁型冠狀病毒(PDCoV)HB-BD株(N基因GenBank登陸號KY129986)，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)HB/HS株(M基因登錄號：JF690779)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬博卡病毒(PBoV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬圓環病毒Ⅱ型(PCV2)均由河北農業大學動物醫學院動物傳染病實驗室分離并保存。

1.2 臨床樣品

2016—2017年在河北省保定市、石家莊市、邯鄲市以及張家口市等地區，發生腹瀉病新生仔豬的腸道內容物130份，-80 ℃保存備用。

1.3 主要試劑

RNA提取試劑盒和Top Green qPCR Super Mix 為TransStart 公司產品；反轉錄試劑盒、DL2000 DNA Marker 、pMD19-T 載體等為TaKaRa 公司產品；羅氏96型熒光定量 PCR儀為羅氏診斷產品(上海)有限公司產品；Nanodrop 2000為美國Thermo Scientific 公司產品。

1.4 引物的設計

根據GenBank中登陸的PDCoV基因序列設計了一對特異性引物，對PDCoV的N基因保守序列進行擴增。上游引物NF1：5′-TACTGGTGCCAATGTCGGCTCTG-3′，下游引物NR1：5′- AGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCAT -3′ 由三博遠志公司合成。根據 GenBank 登錄的 PEDV的M基因序列，設計熒光定量 RT-PCR 引物，PEDVF1：5′-GGTGGTCTTTCAATCCTG-3′，PEDVF2：5′-GCAACCTTATAGCCCTCT-3′。引物由三博遠志公司合成。

1.5 病毒cDNA的獲取

按照RNA提取試劑盒說明書進行病毒核酸的提取，將提取的核酸產物通過反轉錄試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。

1.6 熒光定量RT-PCR方法的建立

1.6.1 標準品的制備 將PDCoV和PEDV的 cDNA分別使用特異性引物進行PCR擴增，擴增體系含有模板cDNA 4 μL，dNTP 3 μL，10×Buffer (2.5 μmol·L-1)2.5 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1)各1 μL，Taq酶(5 U·μL-1) 0.5 μL。PDCoV的反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。PEDV反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 延伸5 min。將擴增的目的基因片段與載體pMD19-T連接并轉化至大腸桿菌DH5α。重組質粒經PCR鑒定并送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果與GenBank 序列比對無誤后，通過Nanodrop 2000測定質粒的OD值，用公式轉換成拷貝數，作為標準品。

1.6.2 單一熒光定量RT-PCR的反應 將制備的標準品分別進行10倍梯度稀釋后進行PCR擴增。每個梯度做三個重復，對擴增結果進行分析，建立各自的標準曲線。同時對其熔解曲線進行分析，以排除引物二聚體及非特異性擴增的干擾。反應體系為SYBR Green I Mix 7.5 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL，上下游引物各(20 μmol·L-1)0.6 μL，模板1.5 μL，去離子水4.6 μL。PDCoV的反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環；PEDV的反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環。同時設置無菌水為陰性對照。

1.6.3 多重熒光定量RT-PCR的反應 對多重熒光定量RT-PCR的反應溫度，反應體系進行優化，確定反應條件。以梯度稀釋的標準品為模板，反應體系為SYBR Green I Mix 7.5 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL，PDCoV上下游引物(20 μmol·L-1)各0.2 μL，PEDV上下游引物(20 μmol·L-1)各0.6 μL，PEDV模板1.2 μL，PDCoV模板0.4 μL，去離子水4.4 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環。同時設置無菌水為陰性對照。

1.6.4 敏感度試驗 用有限稀釋法對標準品進行稀釋，用已經建立的反應條件進行定量檢測，確定其敏感度。

1.6.5 特異性試驗 提取病毒PCV2、PRV、PBoV、TGEV的核酸(其中TGEV的RNA提取后，經反轉錄得到cDNA)，按本試驗所建立的檢測方法進行擴增，同時設置無菌水作為陰性對照，PDCoV和PEDV的混合重組質粒陽性對照，檢測該方法的特異性。

1.6.6 重復性試驗 將同一批不同稀釋度的標準品按建立的方法重復3次進行組內重復試驗，對3次不同時間段稀釋的同一濃度的標準品進行組間重復試驗，對試驗結果進行統計，分析此方法的重復性。同時設置無菌水為陰性對照。

1.7 臨床樣品的檢測

對收集的130份臨床樣品進行檢測，以本實驗室建立的PDCoV和PEDV的雙重SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法與普通RT-PCR檢測方法進行同步檢測，以掌握河北省腹瀉病豬中PDCoV和PEDV的感染情況。

2 結 果

2.1 標準品的制備

用設計的特異性引物對提取的核酸進行特異性擴增，得到PDCoV(262 bp)和PEDV(145 bp)的預期大小基因片段。將PDCoV (262 bp)的片段與PEDV(145 bp)的片段分別克隆至pMD19-T載體后，經序列測定分析，與GenBank相應序列完全一致。重組質粒經Nanodrop 2000測定，PDCoV質粒的濃度為165 μg·mL-1，通過公式換算得到重組質粒的拷貝數為5.1×1010拷貝·μL-1，PEDV質粒的濃度為100 μg·mL-1，通過公式換算得到重組質粒的拷貝數為3.2×1010拷貝·μL-1。圖1為重組質粒PCR鑒定圖。

2.2 標準曲線的建立

將制備的標準品10倍梯度稀釋后進行熒光定量RT-PCR擴增，通過系統自動分析軟件分析，可以得到以拷貝數的對數為縱坐標，Ct值為橫坐標繪制熒光定量RT-PCR的標準曲線(圖2)。由圖2可知，在101～108拷貝·μL-1的范圍內，構建的2個標準品的標準曲線均呈現良好的線性關系，擴增效率均大于90%，相關系數R2均在0.99以上。標準曲線比較理想。

M. DL2000相對分子質量標準；1. PDCoV N基因條帶；2. PEDV M基因條帶M. DL2000 marker; 1. PDCoV N gene stripe; 2. PEDV M gene stripe圖1 重組質粒PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

2.3 熔解曲線的分析

標準品各個稀釋度的熔解曲線有且僅有一個峰值，沒有雜峰出現，其中PEDVM基因的熔解溫度約為85 ℃，PDCoVN基因的熔解溫度約為87 ℃(如圖3A所示)。雙重熒光定量熔解曲線圖如圖3B所示，熔解曲線有兩個特異性峰值，分別為85和87 ℃，陰性對照沒有峰值。

2.4 靈敏度分析

將標準品進行10倍梯度稀釋，按照所建立的條件，進行熒光定量RT-PCR擴增。結果表明，雙重的熒光定量RT-PCR最低可以檢出含51拷貝·μL-1的PDCoV的樣品，含32拷貝·μL-1的PEDV的樣品。

2.5 特異性分析

利用建立的熒光定量RT-PCR方法對PBoV、TGEV、PCV2和PRV進行特異性檢測，并選取PDCoV和PEDV的混合重組質粒以作為陽性對照，以去離子水作陰性對照，結果如圖4所示，除陽性對照外，其他病毒與陰性對照均沒有出現特異性擴增曲線，表明該檢測方法的特異性較好。

2.6 重復性分析

為驗證所建立的檢測方法的重復性，對同一批稀釋的標準品按建立的方法重復3次進行組內重復試驗，并對3次不同時間稀釋的同一濃度的標準品進行組間重復試驗，結果顯示，組內檢測的變異系數為0.327%～1.901%，組間檢測的變異系數為0.622%～2.858%，表明該方法具有較高的可重復性。

圖2 熒光定量標準曲線Fig.2 Fluorometric standard graph

A. 標準品的熔解曲線；B. 雙重熒光定量熔解曲線A. The melting curve of the standard product; B. Two fluorescence quantitative melting curves圖3 熔解曲線的分析Fig.3 Analysis of the melting curve

1.PDCoV和PEDV的混合重組質粒;2～6. PBoV、TGEV、PCV2、PRV和水1.PDCoV and PEDV recombinant plasmid; 2-6. PBoV, TGEV, PCV2, PRV, and water圖4 特異性檢測Fig.4 Specificity detection

2.7 臨床樣品的檢測

用本試驗所建立的PDCoV和PEDV的雙重熒光定量RT-PCR檢測方法，與普通RT-PCR檢測方法分別對來自河北省不同地區的130份臨床樣本進行檢測。檢測結果顯示，普通RT-PCR檢測方法檢出率較雙重熒光定量RT-PCR檢測方法檢出率低，雙重熒光定量RT-PCR檢測方法PDCoV的檢出率為16.9%(22/130)，PEDV的檢出率為66.2%(86/130)，二者同時感染的檢出率為2.3%(3/130)，普通RT-PCR檢測方法的PDCoV檢出率為11.5%(15/130)，PEDV的檢出率為60.8%(79/130)，二者同時感染的檢出率為0.8%(1/130)，結果提示這兩年引起仔豬腹瀉的主要病原仍為豬流行性腹瀉病毒。

3 討 論

PDCoV又稱δ冠狀病毒，是繼α冠狀病毒屬的PEDV和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)之后，發現的又一能引起豬腹瀉的冠狀病毒，可引起各個年齡段豬的嘔吐和腹瀉，以及哺乳仔豬的脫水和死亡[10]。豬流行性腹瀉是由PEDV引起仔豬腹瀉、嘔吐的一種高致死性的腸道傳染病[11]。兩者發病率均較高，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失，目前二者并沒有有效的藥物進行防治，且在發病癥狀，病理變化上均無明顯差異，又易發生混合感染，因此，建立一種快速、準確而又靈敏的檢測手段，對PDCoV和PEDV進行多重檢測，是非常有必要的。

近年來，多重RT-PCR的診斷方法已被很多學者用于病原混合感染的鑒別診斷。傳統的檢測方法(如細胞分離培養、酶聯免疫吸附試驗等)雖能對病原鑒別診斷，但其具有耗時長、檢測靈敏度低的缺點。而多重熒光定量RT-PCR技術是目前鑒別診斷二者的最為快速、靈敏的方法。胡慧等建立了PDCoV和TGEV的多重RT-PCR檢測引物及檢測方法，其對PDCoV和TGEV的最低檢測量分別為40.5和547拷貝·μL-1 [12]；任玉鵬等建立一種同時檢測PEDV、TGEV、PDCoV的多重RT-PCR方法，其最低檢測量分別為60.96、102.69和58.85 pg[13]；陳小芬建立了一種檢測PEDV、TGEV和PDCoV三重RT-PCR檢測方法，檢出PEDV、TGEV、PDCoV的最低含量分別為33.4、28.56、322.3 pg[14]。本研究建立了一種檢測PDCoV和PEDV 的雙重SYBR Green I熒光定量PCR方法，與以上學者的結果相比，結果更為靈敏，敏感度更好一些。

SYBR Green I染料是一種非特異性染料，可以與DNA小溝進行結合，但其在多重PCR反應中并非均一結合，而會與某些片段優先結合[15]，這就需要對其反應體系進行優化，本試驗就對反應體系進行了優化，并最終確定了PDCoV和PEDV之間的比例。特異性試驗結果顯示，本試驗建立的PDCoV和PEDV的雙重SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，能特異的擴增PDCoV和PEDV的靶基因片段，并利用熔解曲線的特異性峰值進行區分，而PBoV、TGEV、PCV2、PRV及去離子水均未見特異的擴增曲線，提示該方法具有良好的特異性。對2016年至2017年在河北省不同地區收集的130份臨床樣本進行PDCoV檢測，結果顯示，PDCoV的檢出率為16.9%，PEDV的檢出率為66.2%，二者同時感染的檢出率為2.3%，提示這兩年引起仔豬腹瀉的主要病原仍為PEDV，但河北省豬群中存在PDCoV的感染，應加強該病的防控。

4 結 論

建立了一種快速檢測豬丁型冠狀病毒(PDCoV)與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的雙重SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法，其對PDCoV和PEDV的最低檢測量分別為51和32拷貝·μL-1，與PBoV、TGEV、PRV、PCV2無交叉反應，特異性較好。用其檢測130份仔豬腹瀉樣本，PDCoV檢出率為16.9%，PEDV檢出率為66.2%，二者同時感染的檢出率為2.3%。為PDCoV和PEDV的診斷及分子流行病學調查提供了一種快速、定量檢測方法。

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2.2.3 教練員對運動員文化學習的監管情況 教練員與文化課老師就運動員的文化學習進行溝通、交流的情況，在一定程度上也會左右運動員的學習態度。調查發現，絕大多數教練員勤于與文化課老師進行溝通，這對于運動員的學習將會起到良好的監管和督促作用。只有個別教練員表示與文化課老師交流情況“一般”。顯然，這不利于幫助運動員端正學習態度。這可能是由于教練員自身訓練和比賽的壓力較大，缺少時間，交通不便等，從而與文化課教師疏于溝通和配合。

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