菌株Lactobacillus casei-16發酵豆漿的抗氧化特性研究

唐宇，張將，高原，李喚宇，張雨晴，宮悅，妥彥峰

（大連工業大學食品學院，遼寧大連116034）

隨著社會的發展，健康在人們的眼中變得越來越重要，如何活的更加健康已經成為人們的重要議題。而很多研究發現，氧化對健康造成了很嚴重的影響。氧化損傷在很多常見疾病中均起到一定的作用，如癌癥、炎癥、免疫性疾病、心血管疾病等[1]。而且氧化也會導致機體處于亞健康的狀態[2]。人體內氧化損傷主要是由氧化應激反應（自由基）造成的，人體內95%的自由基為氧自由基[3]。

大豆原產于中國，現在已經是世界上產量最高的農作物之一[4]。而大豆中含有的大豆異黃酮是能夠對人體起到多種的調節和保護作用的物質，具有多種功能特性，其中就包含抗氧化作用[5]。除此之外大豆蛋白水解也能夠產生具有抗氧化活性的多種肽分子混合物[6]。因此大豆可以作為一種良好的抗氧化食物。吳非等[7]發現發酵豆制品的抗氧化活性明顯高于非發酵豆制品；乳酸菌和霉菌發酵都能夠使豆乳的抗氧化活性提高，不同菌株提高的程度不同。翟齊嘯等[8]發現乳酸菌發酵可以通過改變豆乳中糖苷和苷元類物質的組成來提高酸豆乳對鎘暴露導致氧化損傷的保護作用。徐寅等[9]對Streptococcus thermophilusgrx90發酵豆乳的抗氧化活性進行研究，發現發酵豆乳的體外抗氧化性顯著的高于未發酵豆乳。

本試驗菌株為大連工業大學大連市益生菌功能研究重點實驗室保存的5株菌，通過測定菌株發酵的效率、菌株發酵豆漿產β-葡萄糖苷酶活力的特性及豆漿清除DPPH自由基的特性，選出一株發酵豆漿綜合性能最好的菌株。提取其有效成分，用高效液相色譜分析發酵前后苷元型大豆異黃酮含量的變化、進行氧化自由基吸收能力測定（Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC）及細胞抗氧化實驗等進一步分析發酵豆漿提取物的抗氧化效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆為大連市市售大豆；發酵菌株為大連工業大學大連市益生菌功能研究重點實驗室保存菌株，如表1所示；HepG-2肝癌細胞，由國家海洋食品工程中心林松毅教授提供；亞甲藍購自美國Aladdin公司；冰醋酸（色譜純）購自天津科密歐化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、4-硝基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosidep-Nitrophenyl，pNPG）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、水溶性維生素E（Trolox）、熒光素鈉（Fluorescein sodium，FL）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪） 二鹽酸鹽（2，2 ′-Azobis （2-amidinopropane） dihydrochloride，AAPH）均購自于美國Sigma公司；杜爾貝科改良伊格爾培養基（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）購自于美國Gibco公司。

表1 試驗使用菌株Table 1 The strains of the experiment

1.2 主要儀器設備

KG-SX-500滅菌鍋：上海精密實驗設備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；FQC生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；S210-k精密pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；5804R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；1510酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；FD-IC-5D冷凍干燥器：北京博醫實驗儀器有限公司；ScanVac真空濃縮儀：丹麥Labogene公司；MCO-18AIC CO2培養箱：日本SANYO公司；Waters 2695高效液相儀、PDA檢測器：美國Waters公司；200-PRO熒光酶標儀：瑞士Tecan公司；CKX41倒置電子顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株富集培養

試驗所用菌株均為-80℃保存（大連工業大學大連市益生菌功能特性研究重點實驗室提供）。凍存菌株37℃解凍，振蕩均勻后，取0.1 mL接種于5 mL的MRS液體培養基中37℃培養18 h，連續傳代2次后，于4℃保存待用。

1.3.2 豆漿發酵

用去離子水清洗大豆后，加入豆重2倍的水浸泡12 h，再加入4倍干豆重去離子水，進行磨漿。用雙層紗布對磨好的豆漿進行過濾。再將過濾后的豆漿，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在105℃條件下，滅菌15 min。待豆漿冷卻后接種豆漿體積分數2%的菌液，于37℃發酵，發酵時間分別為6、12、18、24 h。測定不同發酵時間的pH值、β-葡萄糖苷酶活力、DPPH自由基清除能力，篩選出具有良好發酵特性及自由基清除能力的菌株，用于進一步試驗。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活性測定

本文參考Zhai等[10-11]的方法，以4-硝基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）為底物測定酶活力測定。分別取5株菌發酵 6 h、12 h、18 h、24 h的豆漿各 0.1 mL 加入0.2 mL 5 mmol/L pNPG（0.1 mol/L pH7.0，PBS緩沖溶液），37°C水浴加熱30 min，然后立即加入0.4 mL 4℃0.5 mol/L Na2CO3溶液終止反應。于4℃條件下，10 000 r/min離心20 min，測定上清液405 nm吸光值。另外，取相同條件的反應液（0.1 mL豆漿、0.2 mL pNPG溶液）立即置于沸水浴中加熱5 min滅活后加入5.0 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，作為空白對照。以對硝基苯酚為標準品，測定不同濃度對硝基苯酚溶液在波長400 nm處的吸光度值，以濃度為橫坐標、OD400為縱坐標繪制標準曲線。酶活力單位表示為U，是每分鐘催化形成一個微摩爾對硝基苯酚所需要的酶量。

式中：Um為單位體積樣品中β-葡萄糖苷酶活力，mU/mL；X為標準曲線計算后的對硝基苯酚濃度，μmol/L；V1為總反應液體積，L；N 為稀釋倍數；T 為反應時問，min；V2為樣品體積mL。

1.3.4 清除DPPH自由基的能力

測定DPPH自由基的清除能力，是一種常用的抗氧化特性測定法方法。試驗中通過測定5種菌不同發酵時間（6、12、18、24 h）清除 DPPH 自由基的能力來分析發酵豆漿的抗氧化能力，方法參照Yin J Y[12]的方法并加以修改；分別取5 mL豆漿和發酵豆漿與蒸餾水5 mL按照1∶1混合，在10 000 r/min，8℃條件下離心10 min。取1 mL離心上清液，加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液，室溫下（20℃～25℃）放入黑暗的環境下反應30 min；4 000 r/min離心10 min取上清，于517 nm測上清液吸光度。

按公式計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100，式中：Ai為 1 mL DPPH+1 mL樣品的吸光度；Aj為1 mL蒸餾水+1 mL樣品的吸光度；Ac為1 mL DPPH+1 mL蒸餾水的吸光度。

1.3.5 發酵豆漿有效成分的提取

綜合分析發酵豆漿pH值、DPPH自由基清除率、β-葡萄糖苷酶活性的結果，從參與豆漿發酵的5株菌種中，篩選出一株發酵豆漿綜合性能最好的菌株，進行豆漿的大量發酵并提取有效成分。

參考Yu-Fei的方法[13]，將發酵24 h豆漿和未發酵的豆漿于-30℃預凍，然后用凍干機凍干，用80%乙醇或水作提取液對豆漿凍干物進行重溶，每克凍干產物，加20 mL的提取液，于室溫超聲萃取6 h，超聲功率為100 W。將超聲完畢的提取液離心取上清，條件為4℃，10 000 r/min離心10 min。乙醇提取液用真空濃縮儀凍干，水提取液用凍干機凍干，將提取物密封保存于-80℃冰箱中。

1.3.6 高效液相色譜測定大豆異黃酮

大豆苷元和染料木素是起主要抗氧化作用的大豆異黃酮，大豆苷和染料木苷是它們對應的糖苷配體，通過測定發酵前后，這4種大豆異黃酮含量的變化來分析發酵豆漿抗氧化能力的改變。

將1.3.5中得到的提取物作為樣品分析其大豆異黃酮含量的變化，以4種大豆異黃酮（大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素）標準品用色譜級甲醇配制成濃度為 10、20、50、80、100 μg/mL 的標準液。用高效液相色譜儀分別測出這4種大豆異黃酮的樣品圖，以峰面積為橫坐標、樣品濃度為縱坐標，繪制標準曲線[14]，并得到回歸方程。液相中所有試劑均需用0.22 μm濾膜過濾，以保證儀器的安全使用。

試驗采用Waters2695高效液相色譜儀，搭配2998PDA檢測器，色譜柱：SymmetryC18（5μm，4.6mm×250 mm）；流動相：A為0.5%冰醋酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫條件如表2所示；流速為1.000 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為20 μL；檢測波長為260 nm。

表2 梯度洗脫條件Table 2 The condition of the gradient elution

1.3.7 ORAC抗氧化能力指數測定

參考Huailing Wang等的方法[15-17]將1.2.5中得到的樣品稀釋至 0.2、0.15、0.1 mg/mL，取 20 μL 樣品加入到黑色96孔板中，再加入200 μL 0.96 μmol/L熒光素鈉（FL）。自動混勻37℃孵育5 min。加入20 μL 119.4 mmol/L AAPH，測量熒光值，激發波長485 nm，發射波長538 nm，2 min測定一次，共60個循環，測定溫度為30℃。試驗中所有試劑均用75 mM pH 7.4的PBS溶解。試驗所得的各微孔不同時間點的絕對熒光強度數據與其初始時間的熒光強度相比，折算成相對熒光強度f，以相對熒光強度采用近似積分法計算熒光衰退曲線下面積（AUC）。式中：f0表示初始相對熒光強度；fn表示第n個測定點相對熒光強度。ORAC計算公式為：

樣品相對ORAC值=（AUC樣品-AUC空白）/AUC對照

式中：樣品組為 200 μL FL+20 μL AAPH+20 μL樣品；空白組為 200 μL FL+20 μL AAPH+20 μL PBS；對照組為 200 μL FL+40 μL PBS。

以 Trolox（6.25、12.5、25、37.5、50 μmol/L）濃度為橫坐標，以其相對ORAC值為縱坐標繪制標準曲線。將樣品的相對ORAC代入曲線，得出與該濃度下的樣品具有相同ORAC值的Trolox濃度，經換算使樣品ORAC以Trolox當量（微摩Trolox當量/g）表達。

1.3.8 提取物保護HepG2細胞AAPH氧化損傷試驗

以人肝癌細胞HepG2為對象進行發酵豆漿提取物的細胞抗氧化試驗。首先進行提取物的細胞毒性試驗。將HepG2肝癌細胞接種到96孔板中，接種細胞濃度為4×105個細胞/mL，接種量為每孔100 μL，培養24 h（5%CO2，37℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗 2次，加入無胎牛血清細胞培養基，在培養基中加入提取物，使其終濃度分別為 125、250、500 μg/mL，以未加提取物的作為對照。培養24 h（5%CO2，37℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗2次，以亞甲藍染色法測定HepG2肝癌細胞存活率。亞甲藍染色法參考WOLFE[18]并加以修改：加入 50 μL 亞甲藍染液（98%HBSS、1.25% 戊二醛、0.6 g亞甲藍），37℃孵育1 h。吸去亞甲藍染液，去離子水輕輕浸沒，清洗6次。手甩干，剩余水分超凈臺風干。然后每孔加入100 μL脫色液（50%乙醇、49%PBS、1%冰醋酸），室溫下利用孔板振蕩器振蕩20 min。測定在570 nm的吸光值。計算存活率：

存活率/%=樣品組吸光值/對照組吸光值×100

確定AAPH對HepG2肝癌細胞的半致死濃度：將HepG2肝癌細胞接種到96孔細胞培養板，接種細胞濃度為 2×105個細胞/mL，接種量為每孔 100 μL，培養24h（5%CO2，37℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗 2 次，加入無胎牛血清DMEM培養基，在培養基中加入AAPH溶液（無胎牛血清DMEM培養基），使其終濃度分別為 50、60、70、75、80、85、90、100 mmol/L，以未加AAPH的作為對照，培養2 h（5%CO2，37℃）后，用pH7.4的PBS迅速清洗2次，以亞甲藍染色法測定HepG2肝癌細胞存活率。

提取物對HepG2肝癌細胞AAPH氧化損傷的保護：將HepG2肝癌細胞接種到96孔細胞培養板，接種細胞濃度為2×105個細胞/mL，接種量為每孔100 μL，培養 24 h（5%CO2，37℃）后，用 pH7.4的 PBS 迅速清洗2次，加入無胎牛血清DMEM培養基，在培養基中加入提取物（終濃度 125、250、500 μg/mL），37 ℃孵育1 h后，用pH7.4的PBS迅速清洗2次，添加無胎牛血清DMEM培養基和AAPH（濃度為半致死濃度）。培養2 h（5%CO2，37℃）后，以不添加 AAPH 和提取物的為空白，以添加AAPH不添加提取物的作為對照，以亞甲藍染色法測定HepG2肝癌細胞存活率結果。

1.4 統計分析

試驗中所有試驗至少重復3次，方差分析及差異顯著性分析（p＜0.05）采用SPSS20.0統計分析軟件進行分析，圖表采用OriginPro 8.5進行繪制。

2 結果與討論

2.1 發酵豆漿pH測定結果

不同菌株發酵豆漿pH值變化情況見表3。

表3 不同菌株發酵豆漿pH值變化情況Table 3 The pH of the soymilk fermented by the different strains

如表3所示，在5株菌分別發酵豆漿過程中，經菌株 L.sakei B2-4、E.gilvus B2-10、L.plantarum S2-6 發酵的豆漿pH值下降較緩慢：菌株L.casei-16、L.plantarum Y3-1發酵豆漿12 h，發酵豆漿的pH值基本穩定，與發酵18、24 h后豆漿的pH相比無顯著差異（p＞0.05）：菌株 L.sakei B2-4、E.gilvus B2-10 發酵豆漿 24 h時，發酵豆漿pH達到最低值，與L.casei-16、L.plantarum Y3-1發酵豆漿12 h的pH值無顯著差異（p＞0.05）。菌株L.casei-16、L.plantarum Y3-1發酵豆漿產酸速度較快。

2.2 β-葡萄糖苷酶測定結果分析

大豆中存在的大豆異黃酮包含糖苷型（9種）和苷元型（3種）兩類，其中起主要抗氧化作用的染料木素（genistein）和大豆苷元（daidzein）均為苷元型大豆異黃酮，但大豆中異黃酮主要以糖苷形式存在，苷元型的大豆異黃酮僅占大豆中異黃酮總量的2%～3%[19-20]，β-葡萄糖苷酶能夠水解糖苷型異黃酮末端β-D-糖苷鍵，可以使糖苷型大豆異黃酮轉化為苷元型[21]，因此發酵菌株β-葡萄糖苷酶的活性越高，糖苷型大豆異黃酮轉化為苷元型大豆異黃酮的效率越高，所以可以通過測定發酵豆漿中菌株產β-葡萄糖苷酶的活力，來判斷菌體發酵豆漿的潛在抗氧化能力。

本試驗中5株乳酸菌均能在發酵豆漿過程中產生β-葡萄糖苷酶，但各菌株間所產β-葡萄糖苷酶活性存在差異。不同菌株發酵豆漿不同階段的β-葡糖糖苷酶活性見表4。

表4 不同菌株發酵豆漿不同階段的β-葡糖糖苷酶活性Table 4 The β-glucosidase activity of the soymilk fermented by the 5 strains in different time mU/mL

由表4可知，隨著發酵時間延長，菌株L.casei-16發酵豆漿的β-葡萄糖苷酶活性有一定增強，證明L.casei-16在0至24 h發酵階段能夠持續產酶。且當發酵時間為24 h時，其所產β-葡萄糖苷酶的活性顯著（p＜0.05）高于其它4菌株所產β-葡萄糖苷酶活性。因此推測L.casei-16發酵豆漿中苷元型大豆異黃酮含量較高，抗氧化活性較強。

2.3 DPPH自由基清除率

5株乳酸菌發酵豆漿對DPPH自由基清除能力見表5。

表5 不同菌株發酵豆漿DPPH自由基清除率Table 5 The DPPH free radical scavenging of the soymilk fermented by the different strains%

不同菌株發酵豆漿清除DPPH自由基清除能力存在差異，且隨發酵時間延長，發酵豆漿清除DPPH自由基清除能力發生變化。L.plantarum Y3-1發酵豆漿6 h至24 h，與未發酵豆漿相比，清除DPPH自由基清除能力未發生顯著變化（p＞0.05）：菌株L.casei-16發酵豆漿 18 h、24 h，L.sakei B2-4 發酵豆漿 24 h，E.gilvus B2-10發酵豆漿24 h的DPPH自由基清除率顯著高于（p＜0.05）未發酵豆漿的清除率，而在這些發酵時間段，以上各菌的β-葡萄糖苷酶活性也較高，推斷在此階段發酵豆漿中苷元型大豆異黃酮含量較高。綜合分析L.casei-16發酵豆漿清除DPPH自由基的能力最好。

根據菌株發酵豆漿產酸、β-葡萄糖苷酶活性及DPPH自由基清除率結果，選擇菌株L.casei-16進行后續研究。

2.4 高效液相色譜測定大豆異黃酮結果分析

2.4.1 大豆異黃酮標準曲線

采用高效液相色譜測定了大豆中普遍存在的4種大豆異黃酮，即大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素4種標準品的出峰時間，分別為9.865、10.455、24.707min和31.780 min，如圖1所示。

圖1 4種大豆異黃酮標準品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the isoflavones profile of 4 standard isoflavones

以峰面積作橫坐標，標準品濃度為縱坐標作標準曲線得出4種大豆異黃酮的標準曲線分別為：

染料木苷：Y=0.019X+1.226，R2=0.999

大豆苷：Y=0.034X-0.271，R2=0.994

染料木素：Y=0.006X+2.622，R2=0.999

大豆苷元：Y=0.011X+2.519，R2=0.990

2.4.2 發酵豆漿中大豆異黃酮含量

分別利用80%乙醇和水作為提取劑，分別提取菌株L.casei-16發酵豆漿、及未發酵豆漿提取物，通過高效液相色譜分析醇提物和水提物中4種大豆異黃酮的含量，結果如表6所示。

大豆異黃酮易溶于乙醇、甲醇及丙酮等有機溶劑。無論是菌株L.casei-16發酵豆漿還是未發酵豆漿，醇提物中大豆異黃酮含量均高于水提物中大豆異黃酮含量。

從表6可以看出：豆漿發酵后苷元型大豆異黃酮染料木素和大豆苷元的含量較未發酵豆漿中的含量均有顯著（p＜0.05）提高，證明菌株L.casei-16可以通過發酵提高豆漿中苷元型大豆異黃酮的含量。

表6 豆漿提取物中大豆異黃酮含量Table 6 The concentration of the soybean isoflavone in the soybean milk extracts μg/g

2.5 ORAC抗氧化指標

ORAC即抗氧化能力指數是通過熒光衰退曲線的保護面積與標準抗氧化物質的保護面積相比得出。在目前抗氧化研究中為人們所常用的一種方法，該方法的準確性、精密度及重復性相較于其他的抗氧化方法有一定的優勢。該方法以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由基來源，熒光素鈉（FL）為熒光指示劑，維生素E水溶性類似物Trolox為定量標準，使用熒光微孔板分析儀進行分析[16]。

表7 4種提取物的ORAC值Table 7 The ORAC of the 4 extracts μmol Trolox/g提取物

本試驗中，以Trolox濃度為橫坐標，以對應的相對ORAC值為縱坐標，獲得回歸方程：Y=0.747X-7.817，R2=0.997。

測定豆漿的熒光值，經換算得到的ORAC值如表7所示。

如表7所示，L.casei-16發酵豆漿醇提取物的ORAC值顯著（p＜0.05）高于水提取物的ORAC值和未發酵醇提物的ORAC值；對比L.casei-16發酵豆漿醇提取物和水提物的ORAC結果可以判斷，易溶于甲醇的苷元型大豆異黃酮是發酵豆漿抗氧化物質的重要組分之一；對比L.casei-16發酵豆漿醇提取物與未發酵豆漿醇提物的ORAC結果，結合液相色譜分析結果，發酵提高了豆漿中抗氧化活性成分染料木素（genistein）和大豆苷元（daidzein）的含量。無論是菌株L.casei-16發酵豆漿還是未發酵豆漿，醇提物中苷元型大豆異黃酮含量均高于水提物中苷元型大豆異黃酮含量含量，這可能解釋了醇提物的ORAC值均高于水提物ORAC值的原因。

表8 不同濃度提取物對HepG2肝癌細胞存活率的影響Table 8 The survival rate of the HepG2 cell at different concentrations of the extracts%

2.6 細胞抗氧化實驗結果

ORAC雖然能很好的體現提取物的抗氧化性，但是也有一定的局限性，ORAC屬于體外化學實驗，只能單純的測定出提取物中直接起抗氧化作用物質的抗氧化能力，而不能反映細胞內的抗氧化機理的復雜性。有些本身不具有抗氧化性的物質，卻可以通過調控機體生理作用來提高機體的抗氧化性，因此測定抗氧化最可靠的方法是人體實驗或小鼠實驗，但機體實驗從方便和經濟的角度來說并不算優秀。因此細胞實驗成為一種較為理想的實驗方法，它相較于體外化學實驗更接近于機體細胞的實際情況，相較于人體實驗或小鼠實驗更加便捷經濟[22-23]。

進行細胞實驗的前提是提取物對HepG2肝癌細胞沒有毒性，檢驗L.casei-16發酵豆漿醇提取物、水提物及未發酵豆漿醇提物、水提物對HepG2肝癌細胞的毒性，每種提取物選擇3個濃度梯度（500、250、125 μg/mL），結果如表 8 所示。

由表8可知4種提取物的各濃度梯度對HepG2肝癌細胞均無細胞毒性。

2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）是常用的活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導劑，能夠在機體內穩定促進ROS生成，使機體內產生過量的ROS，導致機體產生氧化損傷[24-25]。因此本試驗以AAPH作為氧化劑，建立HepG2肝癌細胞的氧化損傷模型驗證4種提取物在機體內的抗氧化效果。不同濃度AAPH處理2 h的HepG2肝癌細胞致死率如圖2所示。

圖2AAPH對HepG2肝癌細胞致死實驗結果Fig.2 The survival rate of the HepG2 cell at different concentrations of AAPH

表9 不同濃度提取物對AAPH半致死濃度下細胞存活率的影響Table 9 The survival rate of the HepG2 cells damaged by AAPH at different concentrations of the extracts%

由圖2可知，當終濃度為85 mmol/L時，HepG2肝癌細胞的存活率為（48.87±3.48）%，最接近50%，因此細胞抗氧化實驗中AAPH的半致死濃度選擇為85 mmol/L

不同濃度的4種提取物對HepG2肝癌細胞氧化損傷模型的影響結果如表9所示。

未用提取物處理的細胞的存活率與未發酵豆漿水提物處理過的細胞的存活率沒有顯著差異（p＞0.05），表明未發酵豆漿水提物沒有抑制氧化損傷的效果：未發酵豆漿醇提物僅在終濃度為250 μg/mL時，有抑制氧化損傷的效果。而經不同濃度的L.casei-16發酵豆漿醇提物和水提物處理的細胞存活率顯著（p＜0.05）高于未用提取物處理的細胞的存活率，證明了L.casei-16發酵豆漿醇提物和水提物均有抑制AAPH氧化損傷HepG2肝癌細胞的效果。

結合液相分析的結果來看，L.casei-16發酵豆漿醇提物中染料木素、大豆苷元的含量要顯著（p＜0.05）高于未發酵豆漿醇提物中的含量，說明了染料木素和大豆苷元是主要抗氧化活性成分[25]。L.casei-16發酵豆漿的醇提物及水提物均顯著（p＜0.05）提高了AAPH損傷HepG2肝癌細胞的存活率，同樣濃度下L.casei-16發酵豆漿醇提物和水提物的抗氧化能力無顯著性差異（p＞0.05）。但L.casei-16發酵豆漿的醇提物的苷元型大豆異黃酮含量均顯著（p＜0.05）高于L.casei-16發酵豆漿的水提物含量。因此推測出除苷元型大豆異黃酮發揮清除自由基的功能，可能存在其它L.casei-16發酵豆漿的產物，也起到了保護HepG2肝癌細胞免受AAPH損傷的效果。其中可能性最大的應該是大豆多肽。乳酸菌可以分解大豆蛋白形成多肽，而大豆多肽具有抗氧化性[26-27]。

L.casei-16發酵豆漿醇提物和水提物的終濃度為500 μg/mL 時的細胞抗氧化效果顯著（p＜0.05）的高于終濃度為250、125 μg/mL時的效果，而終濃度為250、125 μg/mL 時，抗氧化效果無顯著差異（p＞0.05）。這說明濃度在250 μg/mL以下時，抗氧化作用的效果較差。

結合ORAC的結果來看，L.casei-16發酵豆漿醇提物的ORAC抗氧化效果和細胞抗氧化效果均顯著（p＜0.05）高于未發酵豆漿醇提物的效果。L.casei-16發酵豆漿水提物和未發酵豆漿水提物的ORAC效果無顯著（p＞0.05）差異，而L.casei-16發酵豆漿水提物的細胞抗氧化效果均顯著（p＜0.05）高于未發酵豆漿水提物的效果。具體原因有待進一步的研究。

3 結論

菌株L.casei-16發酵豆漿具有良好的抗氧化效果。通過L.casei-16發酵，豆漿中染料木素和大豆苷元的含量增加，從而使發酵豆漿抗氧化活性增強；L.casei-16發酵豆漿也可能產生其它代謝產物，具有抗氧化活性，還有待進一步研究。

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