大豆分離蛋白、卡拉膠與肌原纖維蛋白間的相互作用

康偉

（天津生物工程職業技術學院，天津300462）

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是一種重要的功能性蛋白質，在肌肉蛋白質中占到55%左右，除賦予肉制品特有的風味、口感和營養外，其功能特性，如乳化性和凝膠性等還對產品的質構和感官起重要的作用。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）由于營養豐富、含有人體必需氨基酸、不含膽固醇并且價格低廉等特點在肉制品加工生產中應用較多，同時，大豆分離蛋白作為一種優質的植物蛋白，具有良好的持水性、乳化性、凝膠性等特點，將其添加到肉制品中，可降低蒸煮損失、防止肉汁離析、促進水分和脂肪的吸收、改善口感等，可以顯著的改善產品品質，從而達到提高產量的目的[1-3]。當SPI應用于肉制品時，由于SPI的變性溫度遠高于普通肉制品加熱的最高溫度，導致SPI不能與肌原纖維蛋白發生充分的相互作用[4-5]，因此，研究大豆蛋白和其他食用物質進行復配，從而有效的提高肌原纖維蛋白的功能特性。卡拉膠（carrageenan，簡稱CAG）是一種硫酸酯海藻多糖，由于其中硫酸酯基含量和結構的不同，因此卡拉膠具有多種類型。κ-卡拉膠具有極強的形成凝膠的能力，在肉蛋白加熱形成凝膠過程中起到顯著的保水和凝膠增強作用，因此在香腸、午餐肉等熟肉制品中應用較廣。本研究將不同添加比例的CAG、SPI和CAG+SPI復配物添加到肌原纖維蛋白中形成復合蛋白體系，研究對復合蛋白乳化特性，復合凝膠持水性、質構特性、白度和微觀結構的影響，并討論了CAG、SPI及二者復配對肌原纖維蛋白乳化和凝膠特性影響的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背部最長肌：大潤發超市；大豆分離蛋白（食品級，純度99%）：鄭州市紅展化工產品有限公司；卡拉膠（食品級，純度99%）：湖南維興生物科技有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YJ-DTF型精密電子天平：常州市幸運電子設備有限公司；TDL-5M冷凍離心機：常州市儀都儀器有限公司；HH-S6數顯恒溫水浴鍋：金壇市精達儀器制造有限公司；雷磁PHBJ-260型便攜式酸度計：上海寶賽生物科技有限公司；T18高速勻漿機：德國IKA公司；美譜達UV-1800紫外可見分光光度計：浙江賽德儀器設備有限公司；TEX-AN 200型質構分析儀：法國LAMY公司；NR10QC通用色差計：北京京海正通科技有限公司；KH-7700型掃描電子顯微鏡：日本浩視公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

根據Xiong等[6]的方法進行肌原纖維蛋白的提取。將瘦肉切碎，加入4倍體積10 mmol磷酸鹽、0.1 mol NaCl、2 mmol MgCl2和1 mmol乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（Ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA）（pH 7.0）配制成的蛋白提取液均質60 s。用冷凍離心機將勻漿液置于4℃條件，離心轉速3 500 r/min離心15 min，之后倒掉上清，進行3次重復。再加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液勻漿，3 500 r/min下離心15 min，重復3次。最后一次將均質后溶液，用紗布進行過濾，得到的溶液用0.1 mol/L HCl調節pH值為6.0，繼續進行離心，倒掉上清液，收集沉淀。提取需在4℃條件下進行，提取后的肌原纖維蛋白置于4℃的冰箱備用。

1.3.2 復合蛋白體系及凝膠制備

本試驗共分為4組，添加SPI、CAG和SPI+CAG復合蛋白體系及凝膠的制備如表1。

表1 復合蛋白體系的制備Table 1 Preparation of complex protein system %

肌原纖維蛋白濃度為40 mg/mL，復合蛋白體系混勻攪拌30 min，進行以下乳化活性和乳化穩定性的測定，將復合蛋白體系在80℃水浴加熱30 min制備凝膠，冷卻后置于4℃隔夜保藏，測定以下指標。

1.3.3 復合蛋白乳化活性及乳化穩定性的測定

根據Pearce等[7]的方法。復合肌原纖維蛋白溶液的乳化活性（Emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性（Emulsifying stability index，ESI），計算公式如下：

式中：A500為500 nm波長處的吸光度；φ為油相體積分數（φ =0.2%）；A0、A10為乳狀液在 0、10 min的吸光度；c為初始蛋白質溶液中蛋白濃度，g/mL；dilution為稀釋倍數。

1.3.4 復合蛋白凝膠持水性（Water holding capacity，WHC）測定

將凝膠從4℃冷藏中取出于室溫下靜置30 min，之后轉移到50 mL的離心管中，在4℃條件下，轉速3 500 r/min離心30 min。將離心管倒置20 min后，用吸水紙吸取凝膠析出的水分，進行稱重。

WHC/%=離心后凝膠凈重/離心前凝膠凈重×100

1.3.5 復合蛋白凝膠質構的測定

將蛋白凝膠取出于室溫靜置30 min，參考王博等[5]的方法并略作修改。將待測樣品平放于測定平臺上，利用物性分析儀進行測量。參數設定如下：探頭型號選擇P/50，下壓距離50%，觸發力為5 g，測試前速率為5 mm/s，測試速率為2 mm/s，測試后速率為5 mm/s。每個樣品進行6次重復試驗。

1.3.6 復合蛋白凝膠白度值（Whiteness，W）的測定

使用色差計測定凝膠的色差，即L*值（亮度值），a*值（紅度值），b*值（黃度值）。試驗過程中每個樣品均進行3次平行試驗，試驗結果取平均值。并根據Park[8]的方法進行白度值計算：

1.3.7 復合蛋白凝膠微觀結構的觀察

參考王博等[5]的方法進行復合蛋白凝膠微觀結構的觀察。

1.3.8 數據統計方法

本試驗用 Statistix 8.1軟件對數據作出分析，SigmPlot 12.0軟件進行作圖，每組數據均做3次獨立的重復平行試驗。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白乳化性能的影響

圖1為添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復合蛋白的乳化活性（圖1A）和乳化穩定性（圖1B）的變化。

當添加濃度0時，即純MP對照組。從圖1可看出，添加SPI、CAG和SPI+CAG的混合蛋白乳化活性和乳化穩定性均顯著高于MP，隨著添加比例的增加呈現顯著上升的趨勢（P＜0.05），復合蛋白的乳化活性和乳化穩定性按大小排序均為：SPI+CAG＞CAG＞SPI，且在同一濃度梯度條件下，SPI+CAG復合蛋白的乳化活性和乳化穩定性均顯著高于SPI和CAG復合蛋白（P＜0.05）。

圖1 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.1 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the emulsifying activity and emulsification stability of myofibrillar protein

當SPI、CAG和SPI+CAG添加量為最大時，與MP組相比，復合蛋白的乳化活性分別提高了47%、84%和96%，同時，復合蛋白的乳化穩定性分別提高了92%、149%和166%。SPI作為一種天然乳化劑，乳化性能好，能很好的促進油脂吸收或蛋白與油脂結合，形成穩定性較好的乳狀液，同時，經加熱后的SPI球蛋白，通過隨機鏈接會形成一些可溶性聚集束，通過疏水鍵相互作用后會形成蛋白凝膠[5，9]，具有保水保油性、乳化穩定性等功能特性，在肉制品中應用較多。有研究表明，卡拉膠作為一種陰離子多糖可以與肌原纖維蛋白發生相互作用，提高蛋白的持水、持油能力，從而形成穩定的復合蛋白體系。由于多糖和蛋白質均具有穩定的乳化特性，在乳化過程中蛋白分子通過吸附在油水界面上，從而可形成具有一定粘彈性的保護膜，因此，推斷多糖和蛋白質混合物也會具有良好的乳化特性[9-10]，在本試驗中，在MP中添加SPI和CAG復配物，二者協同作用使復合體系的乳化性能顯著提高。

2.2 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

圖2表示添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復合蛋白凝膠持水性的變化。

從圖2可以看出，與MP組相比，添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復合蛋白凝膠持水性均呈上升趨勢，且隨著添加量增加，凝膠的持水性增大，其中添加CAG和SPI+CAG均能顯著提高肌原纖維蛋白凝膠的持水性（P＜0.05），當添加量為最大時，CAG和SPI+CAG的凝膠保水性較MP組分別提高了11%和8%，但二者間不存在顯著差異（P＞0.05）。之前研究表明，肉和非肉蛋白的相互作用會影響產品凝膠的特性，對產品的結構起到一定修飾的作用[11]，SPI的肽鏈骨架上含有很多極性基，因此具有很好的吸水性和保水性，最高可吸收并保持自身質量14倍的水分。卡拉膠作為典型的親水膠體，含有豐富的強陰離子性硫酸酯基團，可以與凝膠內部和外部游離的水分子結合，形成氫鍵，最多可吸收自身質量40～50倍的水分[12]，因此，在肌原纖維蛋白形成凝膠的過程中，添加卡拉膠可將肌原纖維蛋白凝膠體系中游離水轉變為不易流動水滯留在凝膠網絡結構中，顯著提高了復合凝膠的持水性能[13]。同時，添加SPI+CAG的復合凝膠兼具SPI和CAG的優點，具有較好的保水效果。

圖2 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響Fig.2 Effect of soy protein isolate and carrageenan on water holding property of myofibrillar gel

圖3 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響Fig.3 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the hardness and springness of myofibrillar gel

2.3 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠質構特性的影響

添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復合凝膠的硬度（圖3A）和彈性（圖3B）的變化如圖3所示。

由圖3A可知，添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG的復合凝膠處理組硬度均顯著高于MP組（P＜0.05），且隨著添加量的增加，3種復合凝膠的硬度均呈現顯著增加的趨勢（P＜0.05），其中添加SPI的凝膠硬度增加最為顯著。當最大添加量時，SPI、CAG和SPI+CAG的復合蛋白比MP分別提高了79%、63%和70%。由圖3B可知，添加SPI的凝膠彈性無顯著變化（P＞0.05），CAG和SPI+CAG復合凝膠的彈性均顯著高于MP（P＜0.05），且添加CAG復合凝膠在添加量為0.6%時差異顯著（P＜0.05），比MP提高了4%，而添加SPI+CAG復合凝膠在添加量為2.4%和3.6%時差異顯著（P＜0.05），比MP分別提高了4%和5%。肌原纖維蛋白在加熱過程中，蛋白受熱結構打開會形成具有三維網絡狀結構的凝膠基質，可將水分子及其他組分束縛進蛋白結構中，而添加SPI的復合蛋白的加熱過程中，可將SPI截留進蛋白凝膠基質中，從而增加了凝膠的硬度和彈性[14]，同時，加熱后的SPI，其蛋白分子從天然狀態解折疊，亞基解離并形成部分的可溶性聚集體，從而增強蛋白質分子內及與水分子間的相互作用[12]。之前的研究表明卡拉膠作為一種陰離子多糖，能與肌原纖維蛋白分子發生相互作用，將蛋白有效地結合在卡拉膠形成的膠體體系內，提高蛋白凝膠的質構特性[3]，此外，卡拉膠在蛋白凝膠形成過程，能吸收大量水分，將游離水分子束縛進蛋白凝膠網格中，增強凝膠硬度和彈性。郝娟等[1]研究表明，大豆分離蛋白對雞肉腸的硬度的影響要遠大于卡拉膠，這與我們的研究結果一致。

2.4 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響

圖4為添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復合蛋白凝膠白度的變化。

由圖4可知，除添加CAG對蛋白凝膠無顯著影響外（P＞0.05），添加SPI和SPI+CAG復合蛋白凝膠的白度值均低于MP凝膠對照組，并且隨著添加比例的增大，復合凝膠的白度值呈顯著降低的趨勢（P＜0.05），添加SPI的復合凝膠白度值在2.4%和3.6%時顯著下降，較MP組降低了5%和6%，而SPI+CAG在3.6%時顯著下降，較MP組降低了4%。因為SPI本身呈現淡黃色，向MP凝膠中添加SPI會使得其白度值降低[15]，但SPI、SPI+CAG添加量較小時，其對凝膠白度影響不大。由于卡拉膠溶于水后形成澄清透明的溶液，將其加入到肌原纖維蛋白凝膠中對凝膠白度的影響不顯著[16]。從圖4中可看出，SPI+CAG復合蛋白凝膠的白度介于SPI和CAG復合凝膠之間，表明添加卡拉膠可在一定程度上減輕SPI對凝膠白度的影響，因此，由于SPI會對肌原纖維蛋白顏色有不利的影響，在肉制品生產加工應用時應適量添加。

圖4 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Fig.4 Effects of soy protein isolate and carrageenan on the whiteness of myofibrillar gel

圖5 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠凝膠微觀結構的影響Fig.5 Effect of soy protein isolate and carrageenan on the microstructure of myofibrillar protein gels

2.5 大豆分離蛋白和卡拉膠對肌原纖維蛋白凝膠微觀結構觀察

添加不同比例的SPI、CAG和SPI+CAG復合蛋白凝膠的微觀結構的如圖5所示。

通過觀察復合凝膠電鏡圖發現，MP凝膠網絡結構趨于松散，形成較大的不規則孔洞，蛋白質排列雜亂，有明顯的斷層，蛋白間的交聯較稀疏：添加SPI的復合凝膠結構較MP凝膠而言，網絡結構松散無序程度降低，但仍存在較多孔洞。而添加CAG組凝膠結構較為規則，孔洞也較小：添加SPI+CAG凝膠結構比較規則，無較多較大的孔洞，網絡結構較致密均勻，網格細小，蛋白質間形成明顯交聯。由于大豆分離蛋白和卡拉膠復配具有較強的油-水結合能力，形成較穩定的蛋白質-多糖的復合體系，這對于致密穩定的蛋白凝膠形成有很大的促進作用，因此，SPI+CAG復合蛋白凝膠的結構最好。相較之下，CAG組的凝膠結構要比SPI組更規則致密，可能是卡拉膠結合水分子的能力要強于SPI，可以將更多的游離水分束縛進凝膠結構[12，16]，從而使蛋白網絡孔洞減少，形成較致密的網絡結構。

3 結論

通過對復合蛋白乳化特性、凝膠持水性、質構特性、白度和微觀結構的測定，可得出，添加SPI、CAG及SPI+CAG復配物的復合蛋白，其乳化活性、乳化穩定性、持水性和硬度均顯著高于MP（P＜0.05），且添加量越大，其增強效果越顯著；而添加SPI的彈性無明顯變化（P＞0.05），添加SPI+CAG復配物的彈性顯著增加（P＜0.05）；復合凝膠的白度值比MP有所下降，添加CAG的白度值無顯著差異（P＞0.05），而添加SPI顯著降低（P＜0.05）。觀察凝膠微觀結果可知，與MP相比，3種添加物均能改善復合凝膠結構，使其趨于致密均勻，其中添加SPI+CAG復配物的效果最為顯著（P＜0.05）。

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