微生物發酵對咖啡提取物揮發性成分的影響

魏敏，宋旭艷，羅誠浩，潘曦，郭國寧

（湖北中煙工業有限責任公司技術中心，湖北武漢430040）

咖啡（coffea.spp.）是茜草科（Rubiaceae）、咖啡屬（coffea）常綠灌木或小喬木，和茶葉、可可并稱為世界三大飲料，是世界第二大貿易產品。目前對咖啡香氣成分及各種影響因素的研究較多，周斌等[1-4]研究了不同溶劑、方法、烘焙時間、不同產地對烘焙咖啡的香氣成分的影響，吳桂蘋等[5]采用電子鼻對咖啡的品質進行了研究，佟世生等[6]對發酵處理和酶解偶聯發酵處理的云南小粒咖啡鮮果和生豆進行電子舌檢測及主成分分析和聚類分析，程金煥等[7]研究了酶促發酵在咖啡初加工過程中的影響；Alonso-Salces等[8]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-電噴霧碰撞誘導解離-串聯質譜在線檢測了咖啡豆中的化學成分，Baggenstoss等[9]研究了咖啡豆烘焙過程中時間-溫度對芳香性成分形成的影響，Frauendorfer等[10]對烘焙前后咖啡豆中的芳香性成分進行了比較分析。本試驗研究產香菌（桑腸桿菌L4-3）發酵對咖啡提取物揮發性成分的影響，鮮見報道，旨在為開發生物產香咖啡香料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

桑腸桿菌Enterobacter mori VL4-3 CCTCC M2012020，從香莢蘭植物的莖中篩選得到，于2012年1月16日保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心；斜面培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，BR）、原始種子培養基（麥芽糖蛋白胨培養基：麥芽糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，BR）：北京三藥科技開發公司；發酵培養基：市售咖啡豆粉粹到60目后，回流提取3 h的濾液；葡萄糖、瓊脂、麥芽糖、蛋白胨、氯化鈉、二氯甲烷、無水硫酸鈉、95%乙醇：國藥集團化學試劑有限公司，AR；馬鈴薯：市售；發酵底物為咖啡提取物：市售咖啡豆（產地巴西）。

SHP-080生化培養箱：上海精宏試驗設備有限公司；YX.350Z滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；HQL 300B恒溫搖床：武漢中科科儀技術發展有限責任公司；Agilent 6890N/5973型氣相色譜質譜聯用儀：安捷倫科技公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物發酵咖啡提取物的制備

用接種環挑取一環L4-3到裝有200 mL液體種子培養基的500 mL三角瓶中，32℃，100 r/min培養48 h。將咖啡豆粗粉和水按質量比1：20混合，回流提取4.5 h后，抽濾，取濾液，115℃滅菌20 min；將產香菌株L4-3接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上，在恒溫培養箱中32℃、pH自然，靜置培養60 h后置于4℃冰箱中；用上述斜面培養物，接種到種子培養基，在32℃，轉速100 r/min條件下振蕩培養28 h，連續轉接3次后制得種子培養液；將種子培養液按體積比18%接種到咖啡濾液中，裝罐量為30%，在pH自然、溫度32℃、轉速100 r/min，避光條件下，發酵48 h，得到咖啡發酵液，抽濾濃縮得到相對密度約為1.3的浸膏，與95%乙醇按質量比1∶3進行醇沉，靜置過夜后抽濾，保留濾液，減壓濃縮，制得黃褐色浸膏，密度為1.16，為微生物發酵咖啡提取物。

1.2.2 揮發性成分GC/MS對比分析

1.2.2.1 同時蒸餾萃取

將5 g微生物發酵咖啡提取物裝入圓底燒瓶中，加入400 mL水，用電熱套加熱至沸騰，另一側的圓底燒瓶中加入200 mL的二氯甲烷，60℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現分層后計時萃取4 h。萃取結束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并濃縮至1 mL，濃縮液用于進行GC/MS分析。同樣的方法進行5 g未發酵咖啡提取物對照的同時蒸餾萃取，進行GC/MS分析。

1.2.2.2 揮發性成分GC/MS分析

HP-5MS（50 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱；進樣溫度：250 ℃；分流比 10 ∶1；載氣：He，1 mL/min；升溫程序：從 50℃（1 min）以 5℃/min升到 250℃（5 min）；傳輸線溫度：250℃；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：50 amu～400 amu；使用WILEY和MINILAB譜庫進行檢索。

2 結果與分析

微生物（桑腸桿菌L4-3）發酵咖啡提取物及其對照的揮發性成分GC/MS分析結果見表1。

表1 微生物發酵咖啡提取物及其對照的揮發性成分GC/MS對比分析Table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the microbial fermented coffee extract and its control

續表1 微生物發酵咖啡提取物及其對照的揮發性成分GC/MS對比分析Continue table 1 Comparative analysis of volatile components in GC/MS between the microbial fermented coffee extract and its control

由表1可知：咖啡提取物對照共分離鑒定出32種揮發性香氣成分，主要包括酮類、高級脂肪酸酯類、呋喃和酚類；微生物發酵咖啡提取物共分離鑒定出34種香氣成分，其中酸類3種（25.48%），烯類7種（11.15%），醇類6種（8.62%），酯類 4種（6.84%），醛類5種（2.21%），酮類5種（2.04%），酚1種（6.46%），烷烴1種，其他雜環化合物2種；微生物發酵咖啡提取物揮發性成分中，新出現了17種香氣成分，主要有異戊醛、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、青葉醛、苯甲醇、3-甲氧基苯乙酮、香蘭素、棕櫚酸乙酯及其他烯酮、烯醛、呋喃、醇、酯等。其中，異戊醛能提調嗅香，3-甲基丁酸是酸性物質成分，增添水果、酒和乳脂等風味，改善辛辣刺激，對喉部有柔和滋潤作用；2-甲基丁酸相對含量較高（約17%），能賦予堅果和黃油的香氣。有些小分子的有機酸、烯酮類、四氫呋喃類物質可能是酯類等大分子物質微生物轉化、氧化分解等代謝產物；香蘭素能增加食品的香莢蘭香氣，豐富香氣提升品質，可能是咖啡液中的阿魏酸、愈創木酚、對乙烯基愈創木酚、4-乙基愈創木酚等經微生物酶體系催化轉化而來；4-甲氧基苯乙酮，有山楂花和類似茴香醛香；雙丙酮醇，有愉快香氣；棕櫚酸乙酯是高級脂肪酸酯，具有淡甜柔和香氣；微生物發酵咖啡提取物中，己酸、2-糠醇、苯乙醇、亞油酸乙酯等成分的含量有不同程度的提高。己酸是低碳鏈的有機酸；2-糠醇帶焦香；苯乙醇具有清甜玫瑰香氣；亞油酸乙酯具有典型的果香味；⑤經微生物發酵，咖啡提取物中的一些大分子成分消失或含量降低，如2-甲基戊酸甲酯、愈創木酚、4-乙基愈創木酚、對乙烯基愈創木酚、苯乙烯、2，4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸丁基-2-乙基己酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯等。鄰苯二甲酸二丁酯及其他兩種鄰苯二甲酸酯類、2，4-二叔丁基苯酚、苯乙烯等屬有害成分，吸入可引起喉部刺激，經微生物酶體系作用而分解、降解，有利于咖啡提取物香氣質的提高。所有這些香氣糅合在一起，賦予發酵咖啡提取物具有咖啡特征香氣的同時，帶有濃郁堅果奶香等豐富、醇厚香氣，其香氣質提高，刺激性、苦澀感、有害物質減少。

3 結論

咖啡提取液經微生物（桑腸桿菌Enterobacter mori L4-3）發酵后，對其揮發性香氣成分影響較大，新增、相對含量變化以及消失的成分較多，賦予發酵咖啡提取物在富有咖啡特征香氣的同時也具有濃郁堅果奶香等豐富、醇厚香氣，刺激性成分減少、苦澀感減少，香氣自然豐富，香氣質提高。本研究旨在研究采用微生物轉化技術提升天然香料品質，為提高天然香料的可用性和經濟價值提供新的參考途徑，并且提供其在食品中的應用轉化理論基礎，未來將進一步深入研究生物技術對天然香原料的提質加工的作用。

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[7]程金煥,何紅艷,李慧敏,等.酶促發酵在咖啡初加工過程中的應用初探[C].昆明:第十六屆中國科協年會——分17精品咖啡豆認證與公平交易及莊園標準化國際論壇論文集,2014

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[9]Baggenstoss J,Poisson L,Kaegi R,et al.Coffee roasting and aroma formation:application of different time-temperature conditions[J].Agric.Food Chem.,2008,56:5836-5846

[10]Frauendorfer F,Schieberle P.Changes in key aroma compounds of criollo cocoa beans during roasting[J].Agric Food Chem,2008,56:10244-10251