不同東北黑木耳中硒含量測量的不確定度評估比較

蔡玉紅，張之鑫，武巍，張國輝，楊建，魏春雁

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（長春），吉林長春130033）

硒是人和動物必須的微量營養(yǎng)元素，世界上有40多個國家缺硒[1]，我國也是一個缺硒的國家，有72%的地區(qū)，22個省份，近7億人生活在缺硒地區(qū)，硒含量高低分布不均，大量農(nóng)作物天然食品中硒含量很低，而且硒不能在動物體內(nèi)合成，缺硒會降低人體免疫力，誘發(fā)癌癥、心血管病、肝病等多種疾病，缺硒地區(qū)必須通過食品或藥品補充硒元素，滿足身體需求[2]。

自然界中的硒分無機硒和有機硒兩種存在方式，無機硒不易吸收，毒性大，有機硒安全，利用率高[3-4]。硒在人體中的正常范圍很窄[5]，正常保健食品的服用量最低 15 μg/d，最高 100 μg/d，非缺硒人群 400 μg/d就有可能中毒，消費者要根據(jù)食品中硒的含量確定硒的日常補充量，不能盲目補硒。

2013年6月1日實施的GB 2762-2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》[6]取消了硒的限量指標(biāo)，對食品中的硒既沒有設(shè)下限標(biāo)準(zhǔn)，也沒有上限控制，2017年10月6日實施的GB2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》[7]標(biāo)準(zhǔn)同樣沒有硒含量的限制。但是，消費者面對市場上琳瑯滿目的富硒食品時，硒含量高低仍然是首選判斷指標(biāo)。

過去對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度用誤差表示，現(xiàn)在國際上通用不確定度反映測量結(jié)果的可信程度。不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測量值的分散性[8-10]，不確定度是對測定結(jié)果的信息補充，它反映了測量結(jié)果的可信程度的高低，是一定概率的誤差極限，是個確定的值。

本文依據(jù)GB 5009.93-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定方法——熒光分光光度法》[11]，對市場上同一生產(chǎn)廠家普通黑木耳和富硒黑木耳作為實驗材料，測定硒含量[12-21]，按照 JJF1059－1999《測量不確定度評定與表示》[22]和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[23]規(guī)定的基本方法和程序?qū)y量結(jié)果予以不確定度評定，一方面為質(zhì)量監(jiān)管部門提供數(shù)據(jù)支持，特別是當(dāng)產(chǎn)品硒含量很低，處于臨界值時，用包含有不確定的檢測報告作為判斷依據(jù)，從而有效規(guī)范市場，保障消費者的權(quán)益，同時通過對該方法不確定度的評定，發(fā)現(xiàn)實驗中的問題，優(yōu)化和改善實驗條件，提高檢測水平。

1 材料

1.1 試劑與儀器

市售同一生產(chǎn)廠家普通黑木耳和富硒黑木耳：硒單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心，1 000 mg/L，擴展不確定度 2%，k=2）；硝酸、高氯酸、鹽酸（優(yōu)級純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硼氫化鉀、氫氧化鉀、鐵氰化鉀（分析純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

電子天平（感量1 mg，U=3 mg）：中國梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱平板消解儀：北京萊伯泰科儀器有限公司；熒光分光光度計RF-6000：日本島津，設(shè)置儀器條件為：激發(fā)波長376 nm，發(fā)射波長520 nm，測定熒光強度if；單標(biāo)吸管和容量瓶均為天津玻璃儀器廠，A級。

1.2 試樣處理

將黑木耳干品用蒸餾水沖洗干凈后自然風(fēng)干，于60℃真空干燥箱中烘干，粉碎通過40目尼龍篩，干燥貯存?zhèn)溆茫胀ê谀径透晃谀径謩e標(biāo)記為1號、2號試樣。

1.3 試樣制備與測定

分別準(zhǔn)確稱取1號、2號試樣2.0 g于三角瓶中，按GB2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》標(biāo)準(zhǔn)中5.2.1濕法消解，定容100 mL，待測。試樣8次重復(fù)，同時做空白實驗。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

按GB2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》標(biāo)準(zhǔn)中 3.4 配制 0、2.00、5.00、10.0、15.0 μg/L和20.0 μg/L系列硒標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 不確定度分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

試樣中硒元素含量計算公式

式中：X為試樣中硒的含量，mg/kg；C為待測溶液中硒的濃度，μg/L；V為試樣定容體積，mL；m為試樣取樣量，g。

2.2 不確定度的來源

由數(shù)學(xué)模型可知，產(chǎn)生不確定度主要來源見圖1。

圖1 不確定度來源與分析Fig.lThe source of uncertainty and analysis

由圖1可知包括：a.待測液制備引入的不確定度，包括試樣的稱量、消解、定容、稀釋等過程引入的不確定度；b.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制等過程引入的不確定度；c.工作曲線擬合時引入的不確定度；d.重復(fù)測定引入的不確定度；e.回收率引入的不確定度；f.檢測儀器引入的不確定度。

2.3 不確定度分量評定

2.3.1待測液制備過程引入的不確定度urel（X制）

待測液制備過程包括試樣的稱量、消解和定容三個步驟，期間使用了（0.001 g）天平、5 mL吸管、50 mL和100 mL容量瓶。

2.3.1.1 試樣稱量引入的不確定度u（X稱）

天平的校準(zhǔn)證書表明，天平的置信區(qū)間±3.0 mg，k=2。

稱量帶來的不確定度為：2.29 mg。

稱量帶來的相對不確定度為：

2.3.1.2 試樣消解定容引入的不確定度u（X定）

試樣消解、定容、稀釋所用到的容量器具引入的不確定度如表1所示。

表1 測定過程中容量器具引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 1 The relative standard uncertainty from glass container during the determination

1號試樣消解定容用100 mL的容量瓶1次，容量瓶引入的不確定度為u（X定）1號。

2號試樣的硒含量較高，用100 mL的容量瓶定容后，又用5 mL吸管吸取5 mL待測液于50 mL容量瓶定容，稀釋1次，該過程引入的不確定度為u（X定）2號。

待測液制備過程產(chǎn)生的不確定度如下：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel（X標(biāo)）

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度包括購買的有證硒標(biāo)準(zhǔn)溶液及由此稀釋配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液過程中引入的不確定度。

2.3.2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)液 u（ρ1）

1 000 μg/mL，由證書得知，擴展不確定度為0.7%（k=2）。

相對不確定度為：

2.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

該過程按照標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.93-2017中標(biāo)準(zhǔn)曲線制備步驟，配制系列硒標(biāo)準(zhǔn)溶液。測定過程中所用容量器具引入的不確定度[24]見表1所示。

1）配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液引入的不確定度u（ρ2）

配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液使用1 mL吸管2次，10、100 mL容量瓶分別1次。

2）系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（ρ3）

配制系列濃度溶液用5 mL吸管、100 mL容量瓶，由于在工作曲線的測量中已經(jīng)包括量具變化和重復(fù)性誤差，避免重復(fù)，不再評定。

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度u（X擬）

對本文（1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制）標(biāo)準(zhǔn)溶液各點測定2次，取平均值，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與熒光強度檢測結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度－熒光強度結(jié)果及計算Table 2 The results and calculation of Standard solution concentration－fluorescence intensity

用最小二乘法進(jìn)行擬合，建立直線方程y=a+bx，根據(jù)表2所示，繪制硒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖2，得到工作曲線方程：y=115.6x-21.96；R2=0.999。式中：a為直線截距-21.96；b為直線斜率115.6。

圖2 硒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.2 The standard cure of selenium

式中：X為待測試樣濃度的平均值；X0i為工作曲線各點的濃度平均值；SR為工作曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差；X0i為各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值；P為待測試樣重復(fù)測定次數(shù)（P=8）；n 為工作曲線的點數(shù)（n=12）；Y0i為各標(biāo)準(zhǔn)溶液的實際響應(yīng)值；Y0為各標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強度計算值。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度分別為：

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對不確定度分別為：

2.3.4重復(fù)性測定引入的不確定度urel（X重）

每個試樣進(jìn)行8次重復(fù)測定，由直線方程得待測液質(zhì)量濃度，測定結(jié)果及重復(fù)性引入的不確定度見表3。

表3 試樣測定結(jié)果及不確定度Table 3 Determination results of Sample and Uncertainty

2.3.5方法的回收率引入不確定度urel（X回）

方法存在消解損失、消解不完全、轉(zhuǎn)移稀釋損失等因素，添加的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液不能完全進(jìn)入到待測液中，本方法回收率為90%～104%，評定方法的回收率不確定度依據(jù)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》計算如下：

2.3.6 儀器產(chǎn)生的不確定度

在測定過程中，儀器響應(yīng)值會產(chǎn)生一定的不確定度，由于本文對試樣的重復(fù)性、曲線擬合、回收率所產(chǎn)生的不確定度已有評定，在此不再重復(fù)評定儀器引入不確定度。

2.4 試樣含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.1 試樣相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.2 試樣含量

由于2號試樣含量較高，進(jìn)行1次稀釋，所以，定容體積為 100×（50/5）=500

通過上述計算，2個待測試樣含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5 待測樣品的擴展不確定度

2.6 待測樣品的檢測報告

2.7 不確定度分量比較

不確定度分量的計算結(jié)果和比較見圖3。

圖3 不確定度分量貢獻(xiàn)比較Fig.3 Comparison of contribution rate to the uncertainty component

由圖3得出結(jié)論：1）試樣含量高低都會產(chǎn)生一定的不確定度，測量結(jié)果越高產(chǎn)生的擴展不確定度越大，當(dāng)試樣的檢測結(jié)果很低時，特別是處于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的臨界值時，必須評定不確定度，避免錯判漏判。2）實驗方法的回收率引入的不確定度較高，要注意樣品處理的各個環(huán)節(jié)，優(yōu)化實驗過程，減少損失，提高回收率。3）樣品含量低時標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來的不確定度很高，可以通過改進(jìn)實驗條件，如選擇合適濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線、增加標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度的點數(shù)和測定次數(shù)、用較為精密的移液器代替吸管等，提高標(biāo)準(zhǔn)曲線配制的準(zhǔn)確度。4）正確操作原子熒光光譜儀，加強儀器的維護(hù)保養(yǎng)，定期計量檢定和期間核查，使儀器的技術(shù)性能處于良好狀態(tài)。

3 討論

1）不確定度的評估過程繁瑣復(fù)雜，實驗員通過學(xué)習(xí)CNAS-GL05《測量不確定度要求的實施指南》、JJF 1135-2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》等[25-29]資料評估測量結(jié)果的不確定度，2016年新版的《檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》[30]中有《建立和保持應(yīng)用評定測量不確定度的程序》，通過省、部級實驗室認(rèn)證的實驗室對所申請認(rèn)證的檢測參數(shù)都能夠評定不確定度，有能力出具含有擴展不確定度的檢測報告。2）本方法測定的是硒的總量，其中只有有機硒才能有效的被人體吸收。消費者在選擇富硒食品，確定合理的攝入量時要予以考慮。3）《中華人民共和國地方疾病與環(huán)境因素圖集》顯示，從東北三省起斜穿至云貴高原，屬于一條低硒地帶，東北屬于嚴(yán)重缺硒地區(qū)，黑木耳有富集基質(zhì)中硒元素的能力，通過菌絲體將無機硒轉(zhuǎn)換成有機硒，我國東北地區(qū)有著優(yōu)越的黑木耳栽種環(huán)境條件和多年生產(chǎn)經(jīng)驗，黑木耳價格適中，食用方便，消費者可以通過食用富硒黑木耳補充一定的硒元素。

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