5種食藥兩用藥材不同鑒別方法的研究

劉崢，劉金福，2，*，梁寧

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384；3.天津市中藥飲片廠有限公司，天津300110）

中國素有“食藥同源、食藥同理、食藥同用”的歷 史，《神農(nóng)本草經(jīng)》將補(bǔ)虛強(qiáng)壯、延年益壽、無毒或毒性弱、可以久服的藥材劃為“上品”[1]。近年來，藥食兩用中藥材越來越受到人們的親睞，是進(jìn)行食品或保健品開發(fā)的重要原料之一[2]。本論文選擇龍葵、白花蛇舌草等5種食藥兩用中藥材為研究對(duì)象，在現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索，通過中藥材性狀外觀、顯微鑒別、薄層鑒別和理化分析等方法對(duì)其進(jìn)行定性定量分析，使其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加完善，有效控制質(zhì)量，檢驗(yàn)其真?zhèn)危岣呤乘巸捎盟幉臋z驗(yàn)的準(zhǔn)確率，提高企業(yè)原料使用的準(zhǔn)確性及安全性。

圖1 莖表皮細(xì)胞和氣孔圖Fig.1 Stem epidermal cells and stomata

圖2 非腺毛結(jié)構(gòu)Fig.2 Non-glandular hair structure

圖3 莖纖維結(jié)構(gòu)Fig.3 Stem fiber structure

圖4 莖導(dǎo)管結(jié)構(gòu)Fig.4 Stem catheter structure

圖5 種皮石細(xì)胞Fig.5 Pelitic cell

1 材料

1.1 材料與試劑

龍葵，蛇莓，北敗醬草，白花蛇舌草，牡蠣等5種食藥兩用藥材；河北安國藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為龍葵、蛇莓、敗醬草，白花蛇舌草，牡蠣；水合氯醛：成都市科龍化工試劑廠；石油醚、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、三氯甲烷、甲醇：天津市康科德；聚酰胺：天津市光復(fù)精細(xì)化工；硫酸、鹽酸：化學(xué)試劑五廠；木樨草素對(duì)照品、熊果酸對(duì)照品、白花蛇舌草對(duì)照藥材：中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（20 cm×20 cm）：德國默克公司；硅膠G薄層板（10 cm×10 cm）：青島海洋化工廠；硅膠G薄層板（10 cm×20 cm）：煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

CX41顯微鏡：奧林巴斯；SP-30E薄層色譜點(diǎn)樣器：上海科哲生化科技；ZF-2三用紫外儀：上海安亭電子儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HK8200超聲清洗器：美國科導(dǎo)；SX-8-10高溫爐：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別方法研究與建立

2.1.1 龍葵

龍葵（Solanum nigrum L.）在全國均有分布，黑龍江居多，它為一年生草本茄科植物。全草高30 cm～120 cm；莖直立，多分枝；卵形或心型葉子互生，近全緣：球形漿果，成熟后為黑紫色。又名野葡萄、苦菜[3-5]。龍葵與一些茄科植物，其鮮品尚可通過葉形、柔毛的稀密加以區(qū)分，但干品卻極其相似，給使用、分辨帶來一定困難，常造成混用和錯(cuò)用的現(xiàn)象[6]。

2.1.1.1 方法

參照顯微鑒別法[7]試驗(yàn)。采用粉末制片法，徒手切片法，以水裝片、水合氯醛裝片后進(jìn)行觀察制成莖、葉橫切片，進(jìn)行各項(xiàng)顯微特征的觀察；以撕剝法採取了葉的上、下表皮，以水裝片、水合氯醛裝片后進(jìn)行觀察：取藥材粉末，水裝片觀察淀粉粒，水合氯醛加熱透化，稀甘油裝片觀察其他組織細(xì)胞。

2.1.1.2 結(jié)果

結(jié)果見圖1～圖6。

由圖1～圖6可見，本品粉末黃或黃綠色。莖表皮細(xì)胞黃綠色或淺黃棕色，表面觀多角形或類長方形，排列緊密，氣孔為不定式。纖維甚長，直徑22 μm～40 μm，壁稍增厚或較厚，胞腔寬大。莖導(dǎo)管為螺紋、網(wǎng)紋、孔紋或具緣紋孔。種皮石細(xì)胞淡黃色至黃色，表面觀多角形，壁厚，波狀彎曲，層紋清晰。顯著的特點(diǎn)：漿果較大（5 mm～6 mm）。非腺毛長 33 μm～324 μm，由3個(gè)～4個(gè)細(xì)胞組成。極少見腺毛，由2個(gè)細(xì)胞組成，頭部單細(xì)胞。莖薄壁組織有含砂晶細(xì)胞，含草酸鈣砂晶眾多。

圖6 砂晶細(xì)胞Fig.6 Sand crystal cell

2.1.2 蛇莓

蛇莓（Duchesnea indica（Andr.）Focke），薔薇科，多年生草本，全株有柔毛：匍匐莖長。小葉片倒卵形至菱狀長圓形；花單生于葉腋：瘦果卵形，長約1.5 mm，光滑或具不明顯突起，鮮時(shí)有光澤。別名地莓、蠶莓等[8-10]。蛇莓與一些植物，如草莓、樹莓等極其相似，在分辨上帶來了一些困難。

2.1.2.1 方法

同“2.1.1.1”。

2.1.2.2 結(jié)果

結(jié)果見圖7～圖12。

圖7 非腺毛結(jié)構(gòu)（壁有螺狀紋理）Fig.7 Non-glandular hair structure

圖8 非腺毛結(jié)構(gòu)（壁平直）Fig.8 Non-glandular hair structure

圖9 腺毛結(jié)構(gòu)Fig.9 Glandular hairs structure

圖10 葉下表皮細(xì)胞和氣孔Fig.10 Epidermal cells and stomata

圖11 葉上表皮Fig.11 On the leaf epidermis

圖12 草酸鈣簇晶Fig.12 Calcium oxalate cluster crystal

由圖7～圖12可見，本品粉末灰綠色，葉表面觀上表皮細(xì)胞類多角形，垂周壁平直，排列緊密。下表皮細(xì)胞垂周壁波狀彎曲。顯著特點(diǎn)：非腺毛單細(xì)胞，長短不一，長 180 μm～1 300 μm，直徑 20 μm～45 μm，壁平直或表面有螺狀紋理。腺毛長60 μm～125 μm，頭部2個(gè)細(xì)胞，直徑 25 μm～40 μm：柄 2 個(gè)～3 個(gè)細(xì)胞。下表皮氣孔較多，不定式或不等式，葉肉細(xì)胞中含草酸鈣簇晶，直徑 10 μm～38 μm。

2.2 薄層鑒別方法研究與建立

2.2.1 北敗醬草

2.2.1.1 方法

供試品溶液的制備：取本品粉末6 g，加石油醚（60℃～90℃）50 ml加熱回流2次，每次40 min，濾過，濾液棄去，殘?jiān)鼡]去溶劑，加甲醇50 mL加熱回流40 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，加在處理好的聚酰胺柱上（柱層析用聚酰胺，100目～200目，濕法裝柱。內(nèi)經(jīng)2 cm，高4 cm），用水50 mL洗脫，棄去，用50%甲醇20 mL洗脫，棄去，用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得。

對(duì)照品溶液的制備：取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

薄層色譜條件及結(jié)果：照薄層色譜法[7]試驗(yàn)，吸取上述溶液各2 μL～4 μL，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8 mL∶2 mL∶0.5 mL）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱約3 min。置紫外光燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2.1.2 結(jié)果

結(jié)果見圖13、圖14。

圖13 青島薄層板Fig.13 Qing Daothin layer plate

圖14 默克薄層板Fig.14 Merck thin layer plate

從左至右：木犀草素對(duì)照品2 μL、北敗醬樣品-1 4 μL、北敗醬樣品-2 4 μL、北敗醬樣品-3 4 μL。硅膠 G高效薄層板。溫度：22.0℃，相對(duì)濕度：55%。試驗(yàn)室：A-1201。試驗(yàn)日期：2017-4-16。

北敗醬草選用木犀草素作為對(duì)照品是合理的，通過薄層方法的建立有效的提取了木犀草素這一成分，不同廠家薄層板展開效果比較，結(jié)果均顯色清晰，背景小，斑點(diǎn)規(guī)則，證明了該鑒別方法的可行性，為新版《中國藥典》中北敗醬草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考資料。

2.2.2 白花蛇舌草

2.2.2.1 方法

供試品溶液的制備：取本品粉末1 g，加三氯甲烷15 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得。

對(duì)照品溶液的制備：取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

對(duì)照藥材溶液的制備：取白花蛇舌草對(duì)照藥材1 g，同供試品溶液的制備方法，制成對(duì)照藥材溶液。

薄層色譜條件及結(jié)果：照薄層色譜法[7]試驗(yàn)，吸取上述溶液各2 μL～4 μL，分別點(diǎn)樣于同一高效硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（9 mL∶0.9 mL）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。置紫外光燈（365 nm）下檢視,供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2.2.2 結(jié)果

結(jié)果見圖15、圖16。

圖15 默克薄層板Fig.5 Merck thin layer plate

圖16 煙臺(tái)薄層板Fig.16 Yan Tai thin layer plate

從左至右：白花蛇舌草對(duì)照藥材2 μL、白花蛇舌草樣品-1 2 μL、白花蛇舌草樣品-2 2 μL、熊果酸對(duì)照品2 μL、白花蛇舌草樣品-3 2 μL。硅膠G高效薄層板。溫度：25.0℃，相對(duì)濕度：69%。試驗(yàn)室：A-1201。

白花蛇舌草中萜類化合物是主要成分，三氯甲烷超聲處理有效地提取了白花蛇舌草中的萜類化合物。不同廠家薄層板展開效果比較，結(jié)果在薄層板上均顯色清晰，背景小，斑點(diǎn)規(guī)則，說明所用方法耐用，重現(xiàn)性較好。該法操作簡便，并為新版《中國藥典》中白花蛇舌草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考資料。

2.3 牡蠣酸不溶性灰分測(cè)定方法研究

2.3.1 試驗(yàn)方法和結(jié)果

2.3.1.1 不同加酸量的比較

為了更好的測(cè)定，加入了蛤殼、珍珠母做對(duì)比，照灰分測(cè)定法[7]試驗(yàn),在坩堝中分別加入稀鹽酸（濃度9.5%）10、15、20、25、30 mL。根據(jù)殘?jiān)亓浚?jì)算供試品中酸不溶性灰分的含量。結(jié)果見表1，圖17～圖19。

2.3.1.2 持續(xù)加酸比較

照灰分測(cè)定法[7]試驗(yàn)，在坩堝中分別加入稀鹽酸10 mL，進(jìn)行試驗(yàn)。再在已恒重的坩堝中加入稀鹽酸5 mL，觀察氣泡產(chǎn)生情況，依照酸不溶性灰分測(cè)定法自“用表面皿覆蓋坩堝”起，依法測(cè)定。反復(fù)上述操作，至加入稀鹽酸后，無明顯氣泡產(chǎn)生為止。根據(jù)各次恒重的殘?jiān)亓浚?jì)算供試品中酸不溶性灰分的含量。結(jié)果見表2。

表1 不同加酸量對(duì)酸不溶性灰分含量測(cè)定的影響Table1 Different added amount of acid acid insoluble ash component

圖17 不同加酸量對(duì)蛤殼酸灰的影響Fig.17 Effects of different acid content on acid insoluble ash of clamshell

圖18 不同加酸量對(duì)牡蠣酸灰的影響Fig.18 Effects of different acid content on acid insoluble ash of ostreagigastnunb

圖19 不同加酸量對(duì)珍珠母酸灰的影響Fig.19 Effects of different acid content on acid insoluble ash of mother-of-pearl

表2 持續(xù)加酸對(duì)酸不溶性灰分含量測(cè)定的影響Table 2 Effect of the continue adding acid on acid insoluble ash

3 分析與討論

《中國藥典》對(duì)多數(shù)中藥材進(jìn)行了整理澄清和規(guī)范，以及制定了檢驗(yàn)指標(biāo)和限度，但是對(duì)關(guān)于龍葵、蛇莓等食藥兩用藥材分析手段很少，不利于對(duì)它們的研究以及建立有效的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系。通過對(duì)龍葵、蛇莓2個(gè)品種中藥材顯微鑒別方法的研究，找到了其具有代表性的非腺毛、草酸鈣砂晶等顯著的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可供鑒別參照；通過對(duì)北敗醬草、白花蛇舌草2個(gè)品種中藥材薄層鑒別方法的研究，以木犀草素作為北敗醬草的標(biāo)志物和以熊果酸作為白花蛇舌草的標(biāo)志物，結(jié)合地道藥材在層析中顯示的有效成分的比較，可更好的鑒別2種食藥兩用藥材的道地性：一般中藥材為植物或動(dòng)物類有機(jī)物為主，含酸不溶性灰分較少。貝殼類藥材主體為碳酸鈣為主的無機(jī)鹽類。碳酸鈣和稀鹽酸反應(yīng)，產(chǎn)生可溶性鈣鹽，反應(yīng)中消耗大量鹽酸。而按藥典方法加入10 mL稀鹽酸不能使貝殼類藥材的碳酸鈣反應(yīng)完全，剩余碳酸鈣會(huì)造成酸灰超標(biāo)。通過對(duì)加酸量的比較試驗(yàn)研究，取樣量3 g，加入稀鹽酸量在20 mL～25 mL，才能達(dá)到測(cè)定酸不溶性灰分的目的。

4 結(jié)論

通過對(duì)龍葵、蛇莓、北敗醬草、白花蛇舌草及牡蠣5種食藥兩用中藥材的調(diào)查，以道地藥材做比較，加入特征標(biāo)志物，研究建立了以非腺毛、草酸鈣砂晶作為顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的龍葵、蛇莓的顯微鑒別方法和敗醬草、白花蛇舌草的薄層鑒別方法；通過不同加酸量和持續(xù)加酸的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，加入濃度為9.5%稀鹽酸25 mL可以對(duì)牡蠣中碳酸鈣成分進(jìn)行準(zhǔn)確分析。本文為進(jìn)一步完善藥材標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)，研究的成果也可以用于分析檢測(cè)人員的培訓(xùn)，為快速準(zhǔn)確識(shí)別食藥兩用中藥材提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]何清彥.10種藥食兩用中藥材外源性有毒有害物質(zhì)殘留研究[D].湖南:湖南中醫(yī)藥大學(xué),2016

[2]苗青.藥食兩用益智的質(zhì)量控制和蓮子中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)研究[D].吉林:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2013

[3]國家中醫(yī)藥管理局.《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:925-926

[4]騰飛,趙福杰,鄭洪亮,等.龍葵果花色苷的提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(7):240-245,267

[5]胡淑曼,王聰,劉紅兵,等.龍葵藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2016,27(10):2375-2378

[6]郭曉宇,李照福.龍葵和白英的辨別和應(yīng)用[J].首都醫(yī)藥,2005(4):40

[7]中國藥典委員會(huì).《中國藥典》[S].第四部.2015:57-58,200-202,204

[8]李玲玲,黃炎,畢志明.中藥蛇莓的薄層色譜鑒別及含量測(cè)定研究[J].中國新藥雜志,2014,23(18):2203-2206

[9]段軻偉.蛇莓中化學(xué)成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定[D].鄭州:鄭州大學(xué),2012

[10]王強(qiáng).中藥蛇莓的化學(xué)成分研究[D].鄭州:鄭州大學(xué),2006